Los genes y su función: Los Genes son las unidades funcionales del material genético de los cromosomas en el núcleo de cada célula. Este material es conocido como ácido desoxirribonucleico, o ADN, su estructura se parece a dos escaleras espirales (o de caracol) entrelazadas, o de doble hélice doble. Las dos columnas vertebrales o los barandales de las escaleras son largas cadenas compuestas de ácido fosfórico y desoxirribosa, un tipo de azúcar. Los peldaños consisten en cuatro sustancias químicas diferentes, las bases: adenina, guanina, timina, y citosina (abreviadas como A, G, T, C), dos de las cuales siempre se enfrentan en un peldaño de la hélice. Por razones espaciales, los peldaños solo pueden contener un par A-T y G-C. Si la secuencia de estos pares base o letras genéticas en una cadena es por ejemplo:
---AGGCTTAATCGT---
La secuencia de la cadena opuesta debe ser:
---TCCGAATTAGCA---
Las dos cadenas son complementarias una de la otra. La unidad de la información genética, o letra genética, es el nucleótido, una de las bases unidas a una molécula de desoxirribosa, la cual también lleva un grupo de ácido fosforico. Cada una de las 100 mil millones de células del cuerpo humano contienen en su núcleo 46 cromosomas con más de 6 mil millones de letras genéticas, agrupadas en aproximadamente 35 000 genes. Casi todos los detalles de la secuencia de estas letras o nucleótidos son conocidos actualmente. Esta es la información genética de un ser humano individual, y es pasada de generación en generación con pequeños cambios o mutaciones las que, si ocurren, podrían tener consecuencias negativas, pero son necesarios para la evolución de la vida y todas las criaturas vivas.

Proteína distrofina y su gen: La distrofia muscular Duchenne es una de las enfermedades hereditarias más frecuentes del hombre y los mamíferos. Aproximadamente uno de cada 3 500 chicos, independientemente de su origen étnico, nace con esta enfermedad, que es causada por una mutación o daño del gen de la DM Duchenne o gen de la distrofina. El gen de la distrofina fue identificado en 1986 en el brazo corto del Cromosoma X (Kunkel, Boston) y su estructura fue aclarada poco después. Con 2,6 millones de pares de bases, este es uno de los genes más largos alguna vez encontrados: si fuera estirado, este seria de 0,84 mm de largo. Sólo el 0,5 % de los pares de bases, 13 973, pertenece a 79 exones del gene, que combinados juntos contienen la secuencia de codificación activa, la información para la síntesis de las diversas formas de la proteína distrofina. La trascripción de la información genética del gen de la distrofina en ARNm esta bajo el control de al menos cinco promotores, regiones de ADN, las cuales gobiernan el proceso de empalme para que un número de proteínas diferentes sean producidas. El producto principal es la distrofina de extensión completa, una proteína muy larga con forma de varilla que consiste de 3 685 aminoácidos (Hoffman, Washington). Esta tiene un peso molecular de 427 kDa (Kilodaltons), por ejemplo esto es 427 000 veces más pesado que un átomo de hidrógeno. Con una extensión de 125 nm (nanometros, una millonésima de un milímetro); por ejemplo, si 8 000 moléculas (de la proteína) fuvieron reunidas en una línea recta, su longitud total sería solamente de un milímetro. La distrofina esta localizada en el interior de las membranas de célula del músculo, a la que esta anclada por un complejo (o grupo) de muchas otras proteínas. Esta es importante para la estabilidad mecánica de la membrana de célula durante la contracción del músculo. A pesar de su importancia, sólo el 0,002 % del peso de las proteínas del músculo es distrofina, 20 mg por kilogramo de músculo.

Complejo distrófino: Con uno de sus extremos, el terminus amino, la distrofina interactúa con la red β-actina en el interior de la membrana de la célula del músculo. Su otro extremo, el terminus carboxilo, está unido al β-distroglicano, que atraviesa la membrana de la célula y une su lado externo al α-distroglicano y así de esa forma se ancla el aparato contráctil a la superficie extracelular de la membrana, o más exacto, al sarcolema. El complejo proteico entero al que la distrofina pertenece, consiste de más de dos docenas de proteínas diferentes como se ilustra en la ilustración esquemática al final de este informe (reproducido según el permiso de la revista Nature 415, 228, 2002, derechos de autor Macmillan Editores Ltd., http://www.nature.com). Además de las proteínas mostradas, muchos más componentes de este sistema han sido identificados como la disferlina, integrina, telethonina, miotilina, agrina, desmuslina, sincoilina, fukutina, proteína relacionada con la fukutina, spectrina, colágeno y calpaina, con algunos de ellos existiendo en más que una forma. De forma adicional, la red β-actina no aparece en la ilustración. En el futuro, se espera que más componentes sean identificados (Campbell, Iowa City).

Mutación y origen de la enfermedad: La distrofia muscular Duchenne es causada por tres clases diferentes de mutaciones en el gen de la distrofina: las deleciones, si partes del gen faltan, duplicaciones, si partes del gen están duplicadas, y mutaciones puntuales, si solo una letra genética se encuentra cambiada, eliminada o agregada. Como el mecanismo de lectura en los ribosomas siempre lee las palabras del código de tres letras una tras otra sin espaciado, una mutación no trastorna el marco de referencia de lectura si el número de letras faltantes o adicionales puede ser dividido por tres, sin que sobre ninguna letra. En este caso, la distrofina hecha es más larga o más corta. Si este cambio sólo concierne a las estructuras no esenciales de la distrofina como por ejemplo la parte central, esta todavía puede ser en parte funcional. Es entonces, que la forma benigna de la distrofia, la distrofia muscular Becker, se desarrolla. Si la mutación cambia el marco de lectura por una o dos letras, entonces, en la mayor parte de casos, una cadena entera de aminoácidos incorrectos es incorporada a la proteína comenzando en el sitio de la mutación hasta que finalmente alcanza un nuevo y prematuro codón de parada, el cual da por terminada la síntesis. En este caso, la distrofina incompleta no puede realizar completamente su función normal, siendo esta degradada y desarrollándose distrofia muscular Duchenne.

Herencia de la distrofia muscular Duchenne: Además de los 44 cromosomas normales, llamados autósomas, los varones tienen dos cromosomas sexuales diferentes en cada célula de su cuerpo, un cromosoma "Y" y un cromosoma "X". Si su gen de la distrofina en su único cromosoma X es dañado por una mutación, este no puede ser compensado por un gen intacto de un segundo cromosoma X, como es posible para mutaciones en los autósomas, que siempre están presentes en pares. Por lo tanto, la distrofia Duchenne y Becker afectan sólo a varones. Las mujeres, sin embargo, tienen dos cromosomas X en cada célula de su cuerpo. Cuando ellas llevan un gen mutado de la distrofina en uno de sus cromosomas X, el gen intacto en el otro cromosoma X compensa el gen mutado, por lo que ellas no muestran ningún síntoma o solo síntomas clínicos débiles de la enfermedad. Sin embargo, ellas pueden transmitir la enfermedad, siendo portadoras genéticas.

Diagnóstico: El material genético para el diagnóstico de la distrofia muscular Duchenne en chicos, puede ser aislado de glóbulos blancos de la sangre, los leucocitos, obtenidos de sangre líquida. Aproximadamente el 60 % de los pacientes tienen deleciones y aproximadamente el 6 % tiene duplicaciones en su gen de la distrofina. La detección de estas mutaciones es bastante simple después de la multiplicación del material genético por la técnica de reacción en cadena por polimerasa, PCR. Los pacientes quienes no tienen, ni deleciones, ni duplicaciones, aproximadamente el 35 %, tienen mutaciones puntuales, por ejemplo, el cambio de una sola letra genética por otra. Para detectarlos de forma inequívoca, análisis de secuencia deberían ser realizados pero aún no pueden ser ofrecidos en los servicios de análisis. Sin embargo, estos están en desarrollo y podrían estar disponibles dentro de los próximos años (Ray, Toronto). Hay también pacientes sin embargo, cuyas mutaciones no caben en este esquema y cuyos diagnósticos genéticos moleculares plantean demandas especiales a los científicos (Hoffman, Washington).

Posibilidades terapéuticas: Para curar la distrofia muscular Duchenne, la consecuencia de la mutación que dañó el gen de la distrofina, que es la degeneración del músculo, tiene que ser detenida o al menos aliviada. La investigación intenta hacer esto por medio de una terapia génica o por una terapia farmacológica. La terapia génica significa que todas las secciones activas, los exones, del gen intacto de la distrofina, su ADNc, o partes de el, sean introducidos en cada célula muscular, o que el daño específico del gen sea reparado por técnicas genéticas. Una terapia farmacológica significa que se de una sustancia química ordinaria, un fármaco o droga normal, que no tiene nada que ver con un gen, para bloquear o reducir la velocidad de la degeneración del músculo. En ambos enfoques, se han hecho progresos durante los pasados últimos años.

No hay ninguna terapia aún: A pesar de este progreso, ni una terapia génica, ni una farmacológica ha sido desarrollada hasta ahora que pueda curar la enfermedad de los chicos con Duchenne. Sólo en un tipo de fármacos, tres cortico-esteroides estrechamente relacionados, prednisona, prednisolona, y deflazacort, ha sido encontrado que, durante un período limitado de tiempo, pueden reducir la velocidad de la degeneración de los músculos. Sin embargo, muchas veces tienen efectos secundarios severos (vea el párrafo sobre Glucocorticoides mas abajo). Por la severidad de la enfermedad, las familias de los pacientes, sus doctores, y el público en general buscan desesperadamente aun el más pequeño resultado positivo de investigación, y los medios de comunicación, principalmente los periódicos y la televisión, tienden a exagerar pequeños avances como saltos importantes. No sólo los medios de comunicación, los mismos científicos son a menudo sobre-optimistas y pueden declarar los resultados de experimentos con animales como victorias terapéuticas, levantando así falsas esperanzas. Ni un solo chico con Duchenne alguna vez ha sido curado (Dubowitz, Londres).

Experimentos para transferir el gen de la distrofina: es razonable de creer que la transferencia, o el transporte, de cantidades suficientes del gen intacto de distrofina en los núcleos de las células del músculo distrófico podría curar la enfermedad proporcionando la información genética de los nuevos genes que será usada para sintetizar la proteína por los ribosomas de la célula, produciendo cantidades bastante grandes de distrofina funcional que entonces emigraría a su lugar normal bajo la membrana de célula, para ser incorporada en el intrincado complejo distrófino-glicoproteico de forma normal.

Ratones y perros distróficos: La mayor parte de los experimentos para transferir el gen son realizados con una clase de animal de laboratorio: el ratón-mdx distrófico, que tiene una mutación puntual en el nucleótido 3,185 en el exón 23 de su gen de la distrofina. En esta mutación se ha cambiado un codón CAA, que representa un aminoácido glutamina, por un codón TAA, que es un codón de parada, para que la síntesis de distrofina sea parada antes de tiempo y el ratón no tenga ninguna distrofina funcional en sus músculos. Estos ratones no pierden sus músculos, debido a que ellos no desarrollan fibrosis, la proliferación de tejido conectivo, como en los chicos con Duchenne, sus procesos de degeneración causados por la enfermedad no sobrepasen la regeneración. Aunque la transferencia génica pueda ser estudiada con ellos, habría que tener presente que cualquiera de los resultados obtenidos con estos ratones no pueden ser considerados como inmediatamente aplicable a niños sin estudios clínicos adicionales con pacientes con Duchenne. ¡Un niño no es un ratón grande!

Transferencia génica por medio de virus: Para transferir un gen, un transportador, un vector génico es necesario. Un modo de transferir el material genético a células vivas es empaquetarlo en virus, que consisten en una cadena de sus propios genes dentro de una cápsula de proteína. Ellos se anclan a la superficie de una célula viva, introducen sus genes en la célula y luego usan, o esclavizan, el aparato sintetizador de la célula para reproducirse. Principalmente dos clases de virus son usadas como vectores génicos en la investigación de Duchenne, el adeno virus y el diez veces el más pequeño virus adeno-asociado. Estos virus no pueden multiplicarse dentro de la célula objetivo porque los científicos han eliminado casi todos sus propios genes. El virus que mas ventajas tiene parece ser el destripado, prácticamente vaciar el contenido de un adenovirus, que no contenga ningunos de su propios genes, y así tener el espacio para las 14,000 letras genéticas activas, el ADNc, con la información para la proteína entera de distrofina. Con estos virus destripados, en hasta el 30 % de las fibras de músculo de un ratón distrófico, fue sintetizada distrofina nueva seguida de una mejoría de la función del músculo tanto en ratones jóvenes como en los más viejos (Lochmüller, München; Chamberlain, Seattle).

Transferencia génica vía circulación sanguínea: En los experimentos hasta ahora descritos, las soluciones han sido que los virus que contienen el gen de la distrofina fueran inyectados directamente en los músculos de los animales. Para alcanzar todos los músculos, hasta aquellos del corazón y los pulmones, son realizados experimentos para desarrollar un tratamiento sistémico, lo que posibilitaría inyectar los virus en la circulación sanguínea. Para asegurar que nueva distrofina sea sintetizada sólo en las células musculares, otra secuencia genética es agregada al gen de la distrofina en el virus, un promotor CK, el cual tiene1 354 nucleótidos de largo y normalmente activa el gen de la proteína muscular creatina kinasa. Este promotor se aseguraría que el nuevo gen de la distrofina sea activado sólo en células de músculo y no en otra parte.

Transferencia de genes desnudos: Para esta técnica, el ADN del material genético a ser transferido no es incorporado en virus, si no en plasmidos, pequeñas estructuras de ADN circulares sin cubierta de proteína, que existen, a veces en cantidades grandes, en bacterias donde sobre todo dan lugar a la resistencia contra los antibióticos. La ventaja de esta clase de transferencia génica consiste en que los plasmidos no contienen ninguna proteína, sólo material genético, ADN desnudo, para que ninguna reacción inmune se desarrolle contra el material vector. Los experimentos fueron hechos con plasmidos que contenían un marcador o delator de genes, genes cuyas proteínas pueden ser descubiertas en el tejido del músculo por tinción o por la producción de luz para que así el éxito de un experimento de transferencia pueda ser supervisado fácilmente. Cuando volúmenes relativamente grandes de una solución de plasmidos fue inyectada bajo presión en arterias de los miembros de ratas y monos de rhesus, el delator de los genes β-galactosidasa y luciferasa fueron transferidos en hasta el 20 % de las fibras del músculo después de una sola inyección y en hasta el 40 % después de varias inyecciones repetidas. La presión fue creada bloqueando la salida venosa de un miembro durante un corto tiempo. Los experimentos para transferir el gen de la distrofina actualmente son realizados en ratones mdx, monos, y perros GRMD (Wolff, Madison; Braun, Estrasburgo).

Prueba clínica con plasmidos: En Francia, la fase-1 de un estudio clínico con 9 pacientes con Duchenne mayores a 15 años de edad fue iniciado en septiembre del 2000 con administraciones intramusculares de plasmidos que contienen el gen de la distrofina y promotores. Esta fase-1 del estudio es necesario para establecer la seguridad del procedimiento, esto es determinar si habrá alguna inflamación o rechazo inmune, y si alguna nueva distrofina fue creada del todo, producida según la información del gen transferido. Una solución que contiene 200 μg (millonésimo de gramo) de plasmidos con 10 billones (10¹²) de copias del gen de la distrofina fue inyectada una vez en un músculo del antebrazo de los 3 primeros pacientes. Esta es una muy pequeña cantidad de material genético comparado a los experimentos en animales. Los 3 siguientes pacientes recibieron una dosis de 600 μg y los últimos 3 dos dosis de 600 μg cada uno. La seguridad de los pacientes es la preocupación principal, por lo tanto cualquier paciente es tratado sólo cuando se está seguro que el anterior tratado no muestra ningún signo de intolerancia inmune. Es importante acentuar que en esta etapa del estudio, los participantes no sacarán ninguna ventaja clínica de este tratamiento, esto no es una terapia aún. Esta primera prueba durará hasta aproximadamente el final del 2002. (Braun, Estrasburgo; Fardeau, París).

Experimentos para vencer los problemas inmunológicos: (Actualizado en abril del 2002). Como los plasmidos de ADN no contienen ninguna proteína, la transferencia génica con tal ADN desnudo también permite examinar los problemas potenciales con respuestas inmunes hacia la distrofina recién creada sin la interferencia de otras proteínas que son introducidas con otros métodos de transferencia génica como los que usan vectores virales y celulares. Los estudios con ratón mdx han mostrado que las respuestas inmunes son generadas hacia la distrofina humana, pero no a la distrofina de ratón, a pesar de la ausencia de distrofina normal en los músculos de los ratones. La carencia de una respuesta inmune a la distrofina de ratón podría haberse debido a la presencia de otras formas de distrofina. Estos resultados sugieren que respuestas inmunes a la transferencia génica de distrofina no puedan ser un problema particular en pacientes con Duchenne, sobre todo en aquellos con mutaciones puntuales que no interfieren con la síntesis de otras formas de distrofina. El trabajo experimental actual se enfoca en la determinación de cuales otras distrofinas deben estar presentes para permitir la tolerancia inmune al aspecto (forma) del nuevo tipo de distrofina muscular después de la transferencia génica (Wells, Londres).

Células madre: Las células madre existen en muchos tejidos del cuerpo, también en músculos esqueléticos y en la médula ósea. Estas células no-especializadas pueden desarrollar muchas clases de células especializadas, por ejemplo células madre de médula ósea en los diferentes tipos de células sanguíneas, y células madre de músculo en células de músculo nuevas. Estas células pluripotentes son células madre somáticas o adultas, en contraste con las células madre embrionarias que son totipotentes y que pueden desarrollarse en todas las clases de células del cuerpo y células germen. La investigación de células madre para encontrar una terapia para la distrofia Duchenne sólo usa las células madre adultas de animales experimentales, así los problemas éticos unidos con el empleo de células madre humanas embrionarias serian evitados.

Experimentos con células madre de médula ósea: Diez mil a 20 000 células madre, especialmente purificadas de la médula ósea de ratones normales machos, fueron inyectadas en la vena de la cola de ratones-mdx homocigóticos hembras que no tenían ninguna distrofina propia. Tres meses más tarde, distrofina podía ser detectada en hasta el 10 % de las células musculares, y en el mismo 10 % los núcleos de las célula tenían un cromosoma "Y" como prueba de que las células inyectadas sanas del ratón macho se habían fundido con las células del músculo de enfermo. Las células se inocularon vía la circulación sanguínea y traían con ellas la información normal para la distrofina que entonces fue usada para la producción de distrofina funcional. Sin embargo, no fue posible aumentar el número de células de músculo que contenían nueva distrofina normal por encima del 10 % obtenido al principio (Kunkel, Boston).

Experimentos con células madre de músculo esquelético: Células madre obtenidas de músculo fueron aisladas de los músculos esqueléticos de ratones-mdx distróficos, tratadas fuera del animal con un virus vector que llevaba el gen de mini-distrofina, y luego inyectadas de nuevo en la vena de la cola de los ratones distróficos. Después de siete días, fueron encontradas pequeñas cantidades de distrofina en los músculos de los miembros traseros. Esto significa que algunas células madre genéticamente tratadas habían encontrado su camino a los tejidos del músculo. Algunas células también habían emigrado vía la corriente sanguínea a otros órganos incluyendo la médula ósea. Cuando las células madre de músculo purificadas de ratones normales eran etiquetadas con un marcador génico y luego inyectadas en ratones mdx cuya médula ósea fue destruida, las células madre se diferenciaron y se convirtieron en células productoras de distrofina en los músculos esqueléticos. Ellas también aparecieron en el tejido de nervios y vasos sanguíneos. Por lo que así pueden contribuir de formas diferentes a la regeneración de músculo funcional y otros tejidos que normalmente también contienen distrofina y que se carece en animales distróficos y muchachos con Duchenne (Huard, Pittsburg).

Transferencia de mioblastos: En los años 1990 y 1991, una serie entera de estudios clínicos en niños con Duchenne fue realizada con una técnica que había mostrado resultados positivos en ratones-mdx: el uso de mioblastos (mioblastocitos), las células precursoras del músculo, que pueden desarrollarse en células maduras de músculo, obtenidas de un donante sano por lo que contiene el gen normal de la distrofina, y que eran inyectadas directamente en muchos sitios de músculos distróficos. Estos experimentos no fueron exitosos en chicos con Duchenne, porque los mioblastos no emigraron suficientemente fuera de los sitios de la inyección, había problemas inmunológicos y, encima de todo, casi todos los mioblastos inyectados habían muerto después de un corto tiempo (Karpati, Montreal).

Terapia génica ex-vivo con mioblastos, primeros pasos: El aislamiento de células mioblasticas de un paciente con Duchenne, seguido de la introducción del gen correcto de la distrofina y luego de nuevo ser inyectadas prevendría la mayor parte de los problemas inmunológicos. Pero antes de que una terapia génica somática ex-vivo tenga una posibilidad de tener éxito, la supervivencia de los mioblastos en el tejido del músculo después de que el trasplante se ha realizado debe ser mejorada considerablemente. Esto posiblemente puede ser alcanzado induciendo a los mioblastos a sintetizar, al menos durante un cierto tiempo, agentes anti-inflamatorios o factores de crecimiento. Así, los genes para estos agentes tendrían que ser introducidos en los mioblastos antes del trasplante. En experimentos preliminares, usando electroporación, se transportaron plasmidos con un gen para una proteína fluorescente marcadora a través de la membrana celular de los mioblastos humanos en un recipiente de cultivo. Esta técnica transitoriamente hace permeables las membranas con un solo pulso eléctrico, por ejemplo 400 V a través de un hueco de 4 mm. En condiciones óptimas, hasta al 70 % los mioblastos se les transfirió el gen y expresaron la proteína marcadora. La capacidad de los mioblastos para unirse en miotubos, otra etapa de desarrollo del músculo, no fue perjudicada. Así, terapias génicas basadas en la corrección génica y el trasplante de mioblastos humanos pueden beneficiarse de la transferencia génica por electroporación. (Bernheim, Genève).

Cambio de la información genética: Experimentos han sido emprendidos con el objetivo de no introducir una secuencia génica funcional de distrofina en las células de músculo, pero si de cambiar la información genética defectuosa reparando la mutación. Tal técnica tendría cuatro ventajas importantes: (1) los riesgos de una transferencia génica mediada por virus serían evitados, (2) no sólo la distrofina de los músculos esqueléticos, si no todas otras formas de distrofina también serían reparadas, (3) la regulación específica de la producción de distrofina en el tejido sería mantenida, (y 4) la fabricación del agente terapéutico, los oligonucleotidos, probablemente sería más fácil y más barata que la fabricación del virus vectores con el material genético a ser transportado. Los oligonucleotidos son secuencias cortas específicas de ADN, que consisten en unos pocos nucleotidos y que pueden ser fabricados automáticamente.

Reparar el gen: Los intentos para reparar las mutaciones puntuales a nivel génico son hechos usando cortos oligonucleotidos quiméricos, que contienen tanto ARN sobre unas de las cadenas como ADN sobre la otra. La cadena de ADN de los oligonucleotidos quiméricos es perfectamente complementaria a la correcta secuencia génica del sitio de la mutación puntual del gen, mientras que la parte de ARN es perfectamente complementaria a la secuencia mutante. Esto conduce a estructuras cuádruples apareadas, cadenas cuádruples, que son capaces de corregir una mutación tan pequeña activando los mecanismos biológicos de reparación del ADN de la célula. Con esta técnica, un ADN y un ARN oligonucleotido complementario se empalmarian al sitio de la mutación en el gen de la distrofina de perros GRMD distroficos al ser inyectados en un perro afectado de 6 semanas de edad. El músculo tratado mostró: (1) La evidencia de restauración del exon que se omitía debido a la mutación, (2) la restauración de la región codificada de la proteína por el exon faltante dentro de la proteína de completa de distrofina que se localizo correctamente en la membrana del músculo, (y 3), el más importante, la demostración de que el gen en el cromosoma X fue corregido. La reparación de la mutación fue sostenida para casi un año en este perro (Bartlett, Bethesda).

Omisión de exón: Con esta técnica se intenta cambiar una mutación Duchenne en una mutación Becker. Esto puede ser hecho induciendo el mecanismo de empalme, el cual elimina los intrones del ARN pre-mensajero, eliminando también uno o mas exones específicos para que la información genética pase de largo una mutación puntual o restaure el marco de lectura alrededor de una deleción genomica que causa una lectura fuera del marco de lectura. El gen con su mutación no es alterado al omitir el exón, sólo el ARN mensajero, ARNm, el cual no contiene la información del exón omitido. Como el ARNm es más corto de lo normal, la proteína distrofina es también más corta, esta contiene menos aminoácidos. Si los aminoácidos faltantes formaran parte de la región central de la distrofina, no serian esenciales, y la proteína más corta resultante todavía podrá realizar su papel estabilizante en la membrana de las células del músculo. El resultado sería un cambio de los severos síntomas de la distrofia Duchenne a los mucho más suaves síntomas de la distrofia muscular Becker.

Omisión espontánea de exón: Un muchacho con Duchenne quien todavía podía andar a la edad de 14 años se le fue encontrada una deleción génica del exón 45. Cuando él tenía 18 meses, recibió células madre de la médula ósea de su padre a causa, de que en aquel tiempo, él tenía SCID, abreviación en ingles de inmuno deficiencia severa combinada. Esto genero la pregunta de si sus células de músculo contienen distrofina normal hecha con la información genética que había provenido de las células madre sanas de la médula ósea de su padre. Investigaciones con un nuevo material bióptico, sin embargo, ahora han mostrado que los síntomas más suaves de la enfermedad no fueron causados por el trasplante, si no por una omisión de exón debido a la naturaleza especial de su deleción. Además, sus células musculares contienen algunos núcleos de células que provinieron de las células de su padre, las que producen niveles muy bajos de distrofina normal. Así, las células de médula ósea podrían contribuir a la reparación de las células de músculo, pero no lo suficiente para alterar considerablemente el curso de la enfermedad (Kunkel, Boston).

Recombinación homóloga: La mutación puntual en el gen de la distrofina de ratones mdx podría ser reparada en el 15 a 20 % de mioblastos aislados por la adición de una cadena de ADN de 603 nucleótidos con la secuencia correcta en el sitio de la mutación. Parte del nuevo segmento génico fue cambiado al enfrentar un segmento homólogo que contiene la mutación C-T en el exón 23 de los ratones. Esta técnica de recombinación homóloga por fragmento corto, SFHR con sus iniciales en ingles, ahora es aplicada a mioblastos aislados de pacientes con Duchenne con mutaciones de deleción en los exones 45 a 51 y 13. Si es exitosa, esta técnica restauraría el marco de lectura alterado después de donde se ubica la mutación, permitiendo así la reintroducción de los mioblastos corregidos en los músculos del mismo paciente (Kapsa, Melbourne).

Ignorar un codón de parada prematuro por medio de antibióticos: Aproximadamente el 5 % de los chicos con Duchenne tienen una mutación puntual en su gen de la distrofina donde esta cambiada una palabra del código de aminoácidos en uno de los tres codones de parada, TGA, TAG Y TAA, donde, después de la transcripción a ARNm, la síntesis de distrofina es detenida antes de tiempo. La gentamicina es un antibiótico que causa que el mecanismo de traducción del ARN en los ribosomas ignore un codón de parada tan prematuro, esto es leer rápidamente a través de el. Los codones de parada normales, los que están protegidos por una estructura especial tridimensional, sin embargo, serian leídos o usados como antes.

Activación de la utrofina: La utrofina es una proteína similar a la distrofina. En los humanos, esta localizada en el cromosoma 6, tiene muchos exones como el gen de la distrofina y contiene aproximadamente 1 millón de nucleótidos. La proteína utrofina es aproximadamente 7 % más corta que la distrofina, pero tiene una estructura y la función muy similar. Está presente en muchos tejidos del cuerpo, también en el músculo, pero allí se concentra cerca de las uniones neuromusculares, las regiones donde los nervios motores se ponen en contacto con la membrana del músculo. Antes del nacimiento, la concentración de utrofina en el músculo es mucho más alta que después del mismo. Esta proteína, incluso cuando está presente sólo en pequeñas cantidades, hace los síntomas de la distrofia Duchenne menos severos de lo que serían si la utrofina también estuviera ausente. De hecho, en ratones-mdx, cuyo gen de la utrofina fue eliminado experimentalmente, no teniendo ni distrofina, ni utrofina, están realmente enfermos en contraste a los ratones-mdx normales cuyos músculos no se degeneran.

Sintrofina: Las cinco sintrofinas conocidas son proteínas que median la interacción de las proteínas señalizadoras entre los complejos distrófino y utrofino en la membrana de la célula muscular. Los estudios con ratones que carecen de α-sintrofina sugieren que esta forma de sintrofina participa en la regulación de la síntesis de la utrofina o en el ensamblaje del complejo utrofino en la membrana. El entendimiento más detallado de este proceso puede tener consecuencias para una terapia con utrofina (Froehner, Chapel Hill).

Aumento de la expresión de integrina: Hay un número de integrinas, proteínas que unen las células del músculo unas con otras y con su lamina basal circundante, y que también participan en la transmisión de señales de una célula a otra. Los pacientes con Duchenne y Becker tienen más α7β1-integrina que la gente sana, y se ha sugerido que esto puede reducir el progreso de la enfermedad. En ratones severamente distróficos, los cuales no tienen ni distrofina ni utrofina, la cadena α7 de integrina obtenida de ratas fue expresada en ratones transgénicos por medio de un promotor de creatina kinasa como activador, y que condujo también a una cantidad mayor de la sub-unidad β1. Esta manipulación genética aumentó la α7β1-integrina de 2,0 a 2,3 veces la cantidad normal y, como consecuencia, se amplio la longevidad de los ratones al triple, se redujo la cifosis (deformación de la columna), la movilidad fue mantenida, así como la estructura de la unión neuromuscular.

Leupeptina: Esta es un tripeptido que consiste de tres aminoácidos, que inhiben la enzima calpaina. La calpaina destruye las proteínas en las células del músculo cuando el calcio entra de un modo descontrolado, como en la distrofia Duchenne y otras enfermedades neuromusculares. Al unirse la leupeptina con la carnitina, el efecto inhibitorio es aún mayor. En experimentos con monos y ratones, la degeneración del músculo fue inhibida. Los estudios con pacientes son planeados hacia 2002. El fármaco puede ser administrado mas oralmente que por vía inyección. Es posible que la degeneración de músculo en otras enfermedades neuromusculares también pudieran verse influidas con este tratamiento (Stracher, Brooklyn).

Estabilizador de la membrana: La sustancia sintética Polaxamer 188 (P188), que comparte muchas de las propiedades químicas de las membranas, ha sido usada para estabilizar los glóbulos rojos sanguíneos en la anemia falciforme y prevenir el daño a las células del músculo del corazón durante un paro cardíaco. Como la ausencia de distrofina conduce al daño de la membrana del músculo, la P188 podría ser usada para proteger las células del músculo de los efectos de la tensión física. Experimentos con ratones mdx son realizados ahora (Quinlan, Cincinnati).

JNK1: En ratones sin distrofina y sin la proteína muscular MyoD, la señal de proteína JNK1 es activada, causando que se produzca apoptosis, el suicidio de la célula, la que conduce a la degeneración celular del músculo en la distrofia muscular. Este efecto nefasto se debe a la inactivación de la proteína muscular NFATc1. La inyección directa en el músculo de la proteína naturalmente inhibidora JIP1, empaquetada dentro de un adenovirus, dramáticamente redujo la destrucción de la fibra muscular, porque interfiere con la JNK1. Actualmente, péptidos específicos, pequeños pedazos de proteína, dirigida contra la JNK1 son probados como una nueva estrategia terapéutica para detener la degeneración del músculo en la distrofia Duchenne (Megeney, Ottawa).

Óxido nítrico sintetasa: En ratones mdx y pacientes con Duchenne, la cantidad de la enzima oxido nítrico sinte-tasa, ONS, se reducen enormemente en el complejo distrófino de la membrana, por lo que el producto de la enzima, el biológicamente activo gas oxido nítrico, ON, no pueda realizar muchas de sus funciones y su ausencia contribuye a la degeneración del músculo. Un ratón mdx transgénico con la cantidad normal de óxido nítrico sintetasa mostró una considerable reducción de los signos patológicos como la inflamación, lesiones de la membrana y alta actividad de creatina kinasa. Una prueba clínica para probar la eficacia de fármacos anti-inflamatorios en pacientes con Duchenne ha sido iniciada (Tidball, Los Angeles).

Aumento de la regeneración del músculo: Es sabido que la proteína conocida como factor de crecimiento similar a la insulina aumenta la síntesis de proteína, experimentos fueron hechos para determinar si esto podría ser usado para aumentar la regeneración muscular en músculos distróficos. Ratones distróficos fueron creados para que producierán este factor en cantidades relativamente grandes en su tejido muscular, llamado después de eso factor de crecimiento muscular similar a la insulina 1, mIGF1. La masa muscular de estos ratones-mdx transgénicos aumento al menos en un 40 %, mientras la fibrosis y el deterioro del músculo normalmente encontrado en el diafragma y cuadriceps de ratones mdx viejos se redujo significativamente, y la regeneración del músculo aumento considerablemente (Rosenthal, Roma).

Transformando la piel en músculo: La proteína galectina-1 se genera en el músculo esquelético y sus células precursoras, mioblastos y miotubos, y participa en los procesos que conducen a nuevo y regenerado tejido muscular. Se ha demostrado que los fibroblastos, que se desarrollan en tejido conectivo, pueden ser transformados en células musculares cuando son cultivados en cultivos de tejido que contienen galectina-1. Los fibroblastos fueron obtenidos de la piel de ratones recién nacidos y fetos humanos. El trabajo continua para determinar las condiciones bajo las que lo fibroblastos de tejido más viejo de piel podrían ser usados. Tales fibroblastos de la piel podrían ser recogidos fácilmente de un paciente con Duchenne, transformarlos en células de músculo con la galectina-1, entonces ser modificadas genéticamente para sintetizar distrofina normal, y finalmente trasplantadas de nuevo en el paciente (Watt, Londres).

Glucocorticoides, esteroides: Dieciséis estudios clínicos en todo el mundo han probado la eficacia de fármacos derivados de la cortisona, sobre todo la prednisona, para reducir la pérdida de la fuerza muscular de chicos con Duchenne. Entonces, hubo indicaciones de que un nuevo corticoide, el deflazacort, podría actuar de modo similar, pero con menos efectos secundarios. Desde 1992 hasta 1997, fue realizado con la participación de 14 centros musculares alemanes un estudio en el cual el efecto de mantenimiento muscular de los dos fármacos similares fue comparado con la historia natural bien documentada de la enfermedad. Las dosis empleadas eran de 0,75 mg por kilogramo de peso corporal por día para la prednisona y 0,9 mg por kilogramo por día para el deflazacort. Ambos fármacos pueden mantener la fuerza muscular durante al menos dos o tres años y, en casos aislados, pueden prolongar la capacidad de andar hasta los 14 años de edad. El efecto secundario más importante de la prednisona es el aumento de peso en aproximadamente el 20 % de los pacientes. Con el deflazacort, las cataratas leves, opacamiento de la lente del ojo, eran más frecuentes que con la prednisona. Ambos fármacos tenían un efecto de retardación del crecimiento, otros efectos secundarios fueron insignificantes. Después de detenerse la medicación, la degeneración del músculo y crecimiento normal inicio de nuevo.

Creatina: Otra sustancia la cual pudiera disminuir la degeneración muscular, es la creatina, un compuesto natural el cual es usado en grandes cantidades por los atletas para aumentar su rendimiento. La creatina, la forma fosforilatada de la fosfocreatina, provee energía no solo para la contracción muscular si no también para la remoción del calcio superfluo, una de las causas de la destrucción de las células musculares. Experimentos con ratones mdx han mostrado que suplementación con creatina mejora la salud muscular, y pudiera proveer las bases científicas para su uso como terapia coadyuvante en la distrofia Duchenne (Wallimann, Zürich; Rüegg, Lausanne).

Estudios clínicos: Estudios clínicos con chicos con Duchenne serán más y más necesarios en vista del aumento de resultados positivos en experimentos con animales. Después del nulo éxito de las pruebas con la transferencia de mioblastos en pacientes con Duchenne a principios de los 1990’s, los científicos ahora son muy cautelosos cuando planean tales estudios. La planeación de estudios clínico tendría que ser realizada en varios pasos, de los cuales el primero, la fase I, tomaría varios años en estar completamente listo, siendo su propósito que el nuevo tratamiento no viniera acompañado de efectos secundarios inaceptables. Sólo después de ese paso, mas estudios pueden ser iniciados para averiguar si el tratamiento realmente mejora o mantiene la fuerza muscular, la fase II, y después debe averiguarse cual será la dosis óptima, la fase III. Prácticamente todos estos estudios tienen que ser realizados bajo pruebas de control doble-ciego, esto significa, que sólo la mitad de los pacientes recibe la sustancia a ser probada, mientras que la otra mitad recibe un compuesto inactivo, un placebo, ni los pacientes ni los investigadores conocen cual paciente pertenece a cual grupo hasta que la prueba ha sido completada, el código es roto y los resultados son analizados. Estos estudios y los procedimientos de aprobación consumen tiempo, tomando muchos años, y son caros de realizar. Sin embargo, hay ejemplos de tratamientos que alcanzan a los pacientes rápido, como el Gleevec, fármaco que fue aprobado en el 2001 en unos pocos meses sin examinarse todos los efectos secundarios, después de que se mostró que este podría curar aproximadamente al 90 % de los pacientes con cáncer de la sangre, leucemia crónica mieloide.

Detección por CK: En Alemania, los infantes varones pre-sintomáticos con distrofia muscular Duchenne y Becker se detectan por el programa voluntario de detección CK en el cual la enzima creatina kinasa, CK, es determinada en una macnha de sangre seca de chicos de 4 semanas a aproximadamente 6 meses de edad. Desde 1974, más de 500 000 infantes varones han sido analizados. 130 muchachos con distrofia Duchenne (1:3 800) y 28 con distrofia Becker (1:17 900) han sido encontrados. Tales programas serán necesarios en el futuro, porque el progreso de la investigación terapéutica conducirá a estudios con pacientes muy jóvenes quienes no tienen ninguno de lo síntomas clínicos y cuyos músculos están todavía en gran parte intactos. Un tratamiento futuro probablemente será capaz de parar o retardar el proceso distrófico, pero no sustituir el tejido muscular ya perdido (Scheuerbrandt, Breitnau/ Freiburg).

¿Cuándo se tendrá una terapia? La distrofia muscular Duchenne siempre ha acompañado al hombre y también a los animales que tienen músculos esqueléticos. Esta fue descrita correctamente por primera vez en 1851 por el doctor inglés Edward Meryon. Sin embargo, obtuvo después su nombre del médico francés Duchenne de Bolonia, quien describió en 1861 no sólo sus síntomas, sino también su histología. De su modo de herencia, se conoció a principio del siglo 20 que un defecto en el Cromosoma X es responsable de la enfermedad. Pero sólo hasta 1986 era identificado el gen mismo, el gen de la distrofina, (Kunkel, Boston) y poco tiempo después la proteína distrofina fue caracterizada (Hoffman, Washington), la que esta ausente en los chicos con Duchenne. El rápido paso de la investigación genética dio lugar a la esperanza de que pronto sería posible sustituir o reparar el gen y así curar la enfermedad.