I geni e la loro funzione: I geni sono le unità funzionali del materiale genetico nei cromosomi nel nucleo di ogni cellula. Questo materiale è chiamato acido desossiribonucleico, DNA, la sua struttura assomiglia ad una scala arrotolata su se stessa, definita come una doppia elica. Le due strutture portanti della scala sono lunghe catene composte da acido fosforico e desossiribosio, un tipo di zucchero. I pioli della scala sono costituiti da quattro diverse sostanze chimiche, le basi: adenina, guanina, timina e citosina (abbreviate A, G, T, C), due delle quali sono sempre contrapposte una all’altra. Per ragioni di spazio i pioli possono contenere solo le coppie A-T e G-C. Se le sequenze di queste coppie di basi o lettere genetiche su un piolo sono ad esempio:
---AGGCTTAATCGT---
la sequenza sul piolo opposto dovrà essere:
---TCCGAATTAGCA---
I due pioli sono quindi complementari uno all’altro. L'unità dell’informazione genetica, una lettera genetica, è un nucleotide, una delle basi attaccate ad un desossiribosio che è collegata anche con un gruppo di acido fosforico. Ognuna dei 100.000 milioni di cellule umane contiene nel suo nucleo più di 6.000 milioni di lettere genetiche, raggruppate in circa 35.000 geni. Quasi tutti i dettagli delle sequenze di queste lettere sono ora noti. E' l’informazione genetica di un essere umano ed essa è trasmessa da una generazione all’altra con variazioni minime o mutazioni che, quando si verificano, possono avere conseguenze negative, ma che sono state necessarie per l’evoluzione della vita e di tutti gli esseri viventi.

Il gene della distrofina e la proteina: La distrofia muscolare Duchenne è uno dei più frequenti disordini ereditari nell’uomo e nei mammiferi. Circa un bambino su 3500, indipendentemente dalla razza e dalla posizione geografica, nasce con questa malattia, che è provocata da una mutazione o da un danno del gene della distrofina. Il gene della distrofina è stato identificato nel 1986 sul braccio corto del cromosoma X (Kunkel, Boston) e la sua struttura è stata chiarita poco dopo. Con 2,6 milioni di basi, esso è uno dei più grandi geni mai scoperti, se venisse disteso sarebbe lungo ben 0.84 mm !! Solo lo 0,5% delle coppie di basi, 13.973, appartengono ai 79 esoni del gene, i quali combinati insieme contengono le sequenze attive codificanti, l’informazione per la sintesi di diverse forme di distrofina. La trascrizione dell’informazione genetica del gene della distrofina nell’ mRNA è sotto il controllo di almeno 5 promoters, regioni di DNA, che comandano il processo di riassemblamento in modo da permettere la produzione di un certo numero di proteine diverse. Il prodotto principale è la distrofina intera, una proteina molto lunga a forma di corda che consiste di 3685 aminoacidi (Hoffman, Washington). La distrofina ha un peso molecolare di 427 kDa (kilodaltons), cioè è circa 427.000 volte più pesante di un atomo di idrogeno, è lunga 125 nm (nanometro, un milionesimo di millimetro) e si trova all’interno della membrana della fibra muscolare cui è ancorata tramite un complesso di molte altre proteine. La sua importanza è determinante per la stabilità meccanica della membrana durante la contrazione muscolare. A dispetto della sua importanza, solo lo 0.002% del peso delle proteine muscolari è costituito da distrofina, circa 20 mg per kg di muscolo.

Il complesso della distrofina: Con una delle sue due estremità, quella amino-terminale, la distrofina interagisce con la β-actina all’interno della membrana della fibra muscolare. L’altra estremità, carbossi-terminale, è legata al α-destroglicano, che attraversa la membrana cellulare e si collega sul lato esterno con l’α-destroglicano, questo blocca l’apparato contrattile alla superficie extracellulare della membrana, più esattamente al sarcolemma. L’intero complesso proteico cui appartiene la distrofina, consiste di più di due dozzine di diverse proteine come illustrato nella figura. Oltre alle proteine mostrate, molti altri componenti di questo sistema sono stati identificati, disferlina, integrina, telethonina, miotilina, agrina, desmuslina, syncoilina, fukutina, proteine fukutina-related, spectrina, collagene e calpaina, alcune addirittura esistenti in più di una forma. Inoltre l’organizzazione della β-actina non è mostrata nella figura e ci si aspetta che in futuro verranno identificati molti altri componenti (Campbell, Iowa City).

Mutazioni ed origine della malattia: La distrofia muscolare Duchenne è causata da tre diversi tipi di mutazioni del gene della distrofina: delezioni, se mancano una o più parti del gene, duplicazioni, se una o più parti sono duplicate, mutazioni puntiformi, se si verificano cambiamenti, perdite o aggiunte di una o più singole lettere genetiche. Dato che il meccanismo di lettura nei ribosomi legge sempre codici di parole di tre lettere una dopo l’altra senza spazi, una mutazione non sposta il quadro di lettura se il numero di lettere mancanti o aggiunte può ugualmente essere diviso per tre senza che avanzino delle lettere. In questo caso, la distrofina prodotta può essere più lunga o più corta. Se questo cambiamento riguarda solo strutture non essenziali, come ad esempio la parte centrale della distrofina, la proteina può ancora essere parzialmente funzionale, come nel caso della forma più benigna, la distrofia muscolare di Becker. Se invece la mutazione sposta il quadro di lettura di una o due lettere, allora, nella maggioranza dei casi, una intera serie di aminoacidi sbagliati viene incorporata nella proteina dando luogo ad una mutazione fino al punto in cui si raggiunge un nuovo e prematuro codone di stop che mette fine alla sintesi. In questo caso, la distrofina incompleta che ne risulta non riesce a svolgere la sua funzione, viene quindi degradata e si sviluppa una distrofia Muscolare di Duchenne.

Ereditarietà della distrofia muscolare Duchenne: Oltre ai normali 44 cromosomi, detti autosomi, i ragazzi hanno due differenti cromosomi sessuali in ogni cellula del corpo, un cromosoma Y ed uno X. Se il loro gene per la distrofina sul loro unico cromosoma X è danneggiato da una mutazione, esso non viene compensato da un gene intatto o da un secondo cromosoma X, come succede per le mutazioni che si verificano sugli autosomi, i quali sono sempre presenti in coppia. Per questo motivo la distrofia Duchenne e Becker si verifica solo nei maschi. Le donne hanno due cromosomi X nelle loro cellule. Quando presentano un gene per la distrofina danneggiato su uno dei loro cromosomi X, il gene intatto che si trova sull’altro cromosoma X compensa per il gene mutato, in tal modo le donne mostrano minimi segni clinici della malattia o addirittura nessuno. Pur tuttavia possono trasmettere la malattia, sono dei carriers genetici.

Diagnostica: Il materiale genetico su cui viene fatta la diagnosi della DMD/BMD nei ragazzi, può essere isolato dai globuli bianchi, i leucociti, ottenuti dal sangue. Circa il 60% dei pazienti presentano delle delezioni e circa il 6% presenta delle duplicazioni nel gene per la distrofina. Il riconoscimento di queste mutazioni è piuttosto semplice dopo una moltiplicazione del materiale genetico tramite una PCR (polymerase chain reaction). Dei pazienti che non presentano né una delezione né una duplicazione, un 35% ha delle mutazioni puntiformi (cioè lo scambio di una singola lettera genetica con un’altra). Per poter caratterizzare univocamente questo tipo di mutazioni, si devono eseguire delle analisi di sequenze che al momento non possono essere offerte comunemente. Sono però attualmente allo studio altre metodiche che potrebbero essere disponibili in breve tempo (Ray, Toronto). Ci sono anche altri pazienti, tuttavia, le cui mutazioni non rientrano in nessuno degli schemi proposti e la cui diagnosi molecolare è ancora difficile per i ricercatori (Hoffman, Washington).

Possibilità terapeutiche: Per curare la Distrofia Muscolare Duchenne, la conseguenza della mutazione che ha danneggiato il gene per la distrofina, si deve in qualche modo bloccare o almeno diminuire la degenerazione muscolare. La ricerca sta cercando di fare questo sia tramite una terapia genica sia tramite una terapia farmacologica. Per Terapia genica intendiamo una tecnica che sia in grado di reintrodurre in ogni singola fibra muscolare almeno tutte le regioni attive, gli esoni, di un gene per la distrofina intatto, o il suo cDNA, o parte di esso, oppure che in qualche modo tramite una tecnica genetica si possa riparare il danno specifico del gene. Per terapia farmacologica intendiamo quando si interviene con una sostanza chimica, un farmaco, che non ha nulla a che fare col gene, ma che blocca o rallenta la degenerazione muscolare. In ambedue i campi sono stati fatti notevoli progressi negli ultimi anni.

Non c’è ancora una terapia: A dispetto di questi progressi, non esiste ancora alcuna terapia genica o farmacologica in grado di curare un ragazzo affetto da DMD/BMD. Solo alcuni farmaci, tre tipi di steroidi abbastanza simili tra loro, prednisone, prednisolone, e deflazacort, si sono mostrati abbastanza efficaci nel rallentare per un breve periodo la degenerazione muscolare. Purtroppo, spesso possono presentare gravi effetti collaterali (vedi il paragrafo: glucocorticoidi). A causa della gravità della malattia, le famiglie dei pazienti, i loro medici, e la gente in genere sono alla ricerca disperata del più piccolo segno di speranza dalla ricerca, ed i media, principalmente i giornali e le televisioni, tendono ad esagerare i piccoli progressi ed a trasformarli in incredibili scoperte. Non solo i media, i ricercatori stessi sono spesso troppo ottimisti ed annunciano il risultato di sperimentazioni sugli animali come delle vittorie terapeutiche, generando delle false speranze. La realtà è che, purtroppo, neanche un solo ed unico bambino è mai stato curato dalla distrofia muscolare Duchenne. (Dubowitz, Londra).

Esperimenti di trasferimento del gene per la distrofina: E’ ragionevole credere che il trasferimento, o il trasporto, di una quantità sufficiente di un gene per la distrofina intatto nel nucleo di una fibra muscolare distrofica sia in grado di curare la malattia, purché l’informazione genetica del nuovo gene venga usata dai ribosomi che sintetizzano la proteina per produrre grandi quantità di distrofina funzionale, la quale dovrà a questo punto migrare verso il suo normale posizionamento sotto la membrana cellulare ed essere incorporata nel complicato complesso distrofina-glicoproteina.

Cani e topi distrofici: La maggior parte degli esperimenti di trasferimento genico sono realizzati su un particolare modello animale: il topo distrofico mdx, il quale ha una mutazione puntiforme al nucleotide 3185, nell’esone 23 del suo gene per la distrofina. Questa mutazione provoca la sostituzione di un codon CAA, cioè l’aminoacido glutamina, con un codon TAA, cioè uno stop codon, in questo modo la sintesi di distrofina termina prematuramente ed il topo ha una distrofina non funzionale nei suoi muscoli. Questi topi non perdono però i loro muscoli, infatti, non sviluppano la fibrosi, cioè la proliferazione di tessuto connettivo, tipica dei ragazzi Duchenne, per cui il processo degenerativo dovuto alla malattia non supera mai la loro capacità rigenerativa. Sebbene il trasferimento genico possa essere studiato su questi modelli, bisogna ricordare che qualsiasi risultato ottenuto sui topi non può essere considerato immediatamente applicabile ai bambini senza ulteriori approfondimenti sull’uomo. Un bambino non è affatto un topo più grande !

Trasferimento genico mediante i virus: Per trasferire un gene, occorre un trasportatore, cioè un vettore genico. Un modo per trasferire materiale genetico nelle cellule viventi consiste nel posizionarlo all’interno di un virus. Essi si attaccano alla superficie di una cellula vivente, introducono i loro geni nella cellula e costringono l’apparato di sintesi della cellula a riprodurre altri virus. Nella ricerca sulla Duchenne sono principalmente due i virus che vengono studiati, l’adenovirus, e il virus adeno-associato, dieci volte più piccolo del precedente. Questi virus non possono più riprodursi all’interno della cellula ospite, perché i ricercatori hanno eliminato la maggior parte dei loro geni. Il Virus più promettente sembra essere quello definito gutted, un adenovirus praticamente vuoto, che non contiene alcun gene tipico del virus, quindi ha abbastanza spazio per le 14.000 lettere genetiche attive, il c-DNA, che trasporta l’informazione per l’intera proteina distrofina. Con questi virus gutted si è riusciti ad ottenere nuova sintesi di distrofina in una quantità pari al 30% delle fibre muscolari di un topo distrofico, seguita da un miglioramento della funzione muscolare sia in topi giovani che adulti (Lochmüller, München; Chamberlain, Seattle).

Trasferimento genico attraverso la via ematica: In alcuni esperimenti descritti qualche tempo fa, sono state iniettate direttamente nel muscolo degli animali delle soluzioni contenenti il virus che trasportava il gene per la distrofina. Per poter raggiungere tutti i muscoli, anche quelli cardiaci e polmonari, sono stati fatti molti esperimenti che permettessero di sviluppare un trattamento sistemico: cioè la possibilità di iniettare il virus direttamente nel torrente circolatorio. Per essere certi che la nuova distrofina venisse sintetizzata solo nei muscoli è stata aggiunta una ulteriore sequenza al gene per la distrofina che veniva inserito nei virus, il promoter CK. Questa sequenza lunga 1354 nucleotidi, è normalmente in grado di attivare il gene della proteina muscolare protein-kinasi. Questo promoter ci dà la certezza che il nuovo gene per la distrofina venga attivato solo nelle fibre muscolari.

Trasferimento di geni nudi: Per questa tecnica, il materiale genetico che deve essere trasferito non viene inserito in un virus ma in un plasmide, una piccola struttura di DNA circolare senza proteina, che si trova spesso in grandi quantità, nei batteri in cui sono responsabili della maggior parte delle resistenze agli antibiotici. Il vantaggio di questo tipo di trasferimento genico risiede nel fatto che i plasmidi non contengono proteine, ma solo materiale genetico, cioè DNA nudo, quindi non insorge alcuna reazione immunitaria contro il vettore. Sono stati fatti degli esperimenti con plasmidi contenenti alcuni marker o geni "reporter", geni le cui proteine possono essere riconosciute nel tessuto muscolare tramite colorazione o produzione di luce, in modo tale da poter controllare facilmente il successo di un esperimento di trasferimento genico. Quando volumi abbastanza significativi di soluzioni di questi plasmidi venivano iniettate ad alta pressione, nelle arterie degli arti inferiori di ratti o scimmie rhesus, i geni reporter b-galactosidasi e luciferasi venivano trasferiti in almeno il 20% delle fibre muscolari dopo una singola iniezione e in almeno il 40% dopo iniezioni ripetute. La pressione veniva creata bloccando il deflusso venoso dall’arto inferiore per un breve tempo. Sono attualmente in corso esperimenti per trasferire il gene della distrofina nel topo mdx, nelle scimmie e nei cani GRMD - Golden Retriever (Wolff, Madison; Braun, Strasbourg).

Trials clinici sui plasmidi: In Francia è iniziato, nel settembre 2000, un trial clinico in "fase clinica 1" effettuato su nove pazienti Duchenne maggiori di 15 anni; si è utilizzata una somministrazione intramuscolare di plasmidi contenenti il gene per la distrofina ed i promoters. Questo studio in fase 1 è necessario per stabilire la sicurezza delle procedure, ad esempio per determinare se esiste il rischio di infiammazione o di reazioni immunitarie come pure per verificare se veniva o meno prodotta nuova distrofina, secondo le informazioni fornite dal gene traferito. E’ stata quindi iniettata una sola volta, nel muscolo dell’avambraccio dei primi tre pazienti, una soluzione contenente 200 µg (milionesimi di grammo) di plasmidi con 10 trilioni (10¹²) copie del gene per la distrofina. Questa è una quantità estremamente piccola paragonata a quella utilizzata negli animali da esperimento. I 3 pazienti successivi hanno ricevuto una dose di 600 µg e gli ultimi 3 due dosi da 600 µg ognuna. La principale preoccupazione è stata la sicurezza dei pazienti, quindi ogni paziente viene trattato solo quando si è certi che i pazienti precedenti non mostrano alcun segno di intolleranza immunitaria. E’importante sottolineare che in questa fase dello studio, i partecipanti non godranno di alcun beneficio terapeutico, non è ancora infatti un trattamento terapeutico. Questa prima sperimentazione finirà intorno agli ultimi mesi del 2002 (Braun, Strasbourg; Fardeau, Paris).

Sperimentazioni per superare i problemi immunologici: Dal momento che il plasmide non contiene alcuna proteina, il trasferimento genico con questo particolare DNA nudo permette anche di esaminare potenziali problemi legati alla risposta immunitaria nei confronti della nuova distrofina senza l’interferenza di altre proteine che potrebbero essere state introdotte con altri metodi di trasferimento genico che utilizzino vettori virali o cellulari. Gli studi sul topo mdx hanno dimostrato che la risposta immunitaria di solito è diretta verso la distrofina umana ma non verso la distrofina del topo, pur mancando la distrofina normale nel muscolo dei topi. La mancanza di una risposta immunitaria verso la distrofina del topo potrebbe essere dovuta alla presenza di altre forme di distrofina. Questi risultati suggeriscono che la risposta immunitaria al trasferimento del gene potrebbe anche non costituire un grave problema nei pazienti Duchenne, specie in coloro i quali presentano delle mutazioni puntiformi che non interferiscono con la sintesi di altre forme di distrofina. Gli attuali lavori di sperimentazione sono concentrati sulla determinazione di quali altre forme di distrofina debbano essere presenti per indurre una tolleranza immunitaria all’apparire della nuova distrofina muscolare dopo il trasferimento genico (Wells, London, aggiornamento aprile 2002).

Cellule staminali: Le cellule staminali esistono in molti tessuti, anche nel muscolo scheletrico e nel midollo. Esse sono cellule non-specializzate che possono dare origine a molti tipi di cellule specializzate, ad esempio le cellule staminali del midollo possono dare luogo a vari tipi di cellule ematiche e le cellule staminali del muscolo possono originare nuove cellule muscolari. Queste cellule pluri-potenti sono delle cellule somatiche, o cellule staminali adulte, a differenza delle cellule staminali embrionali che sono invece toti-potenti e quindi possono dare origine a tutti i tipi di cellule. La ricerca di una terapia della Duchenne con le cellule staminali utilizza solo cellule staminali adulte provenienti da animali da esperimento, questo a causa dei problemi etici connessi all’uso di cellule staminali embrionali umane.

Sperimentazioni con cellule staminali dal midollo: E’ stata iniettata nella vena della coda di topi femmine omozigoti mdx, che non hanno distrofina, una quantità pari a circa 10/20,000 cellule staminali purificate provenienti dal midollo di topi normali. Tre mesi dopo, è stato possibile evidenziare la distrofina in almeno il 10% delle fibre muscolari, e almeno il 10% dei nuclei delle cellule avevano un cromosoma Y come prova che le cellule sane iniettate si erano fuse con le cellule muscolari malate. Esse erano arrivate a destinazione tramite la circolazione sanguigna ed avevano portato con sè l’informazione normale per la distrofina che quindi era stata utilizzata per produrre distrofina funzionale. Tuttavia, non è stato possibile aumentare oltre il 10%, inizialmente ottenuto, il numero delle cellule muscolari contenenti la nuova distrofina (Kunkel, Boston).

Sperimentazioni con cellule staminali provenienti dal muscolo scheletrico: Alcune cellule staminali derivate dal muscolo sono state isolate dal muscolo scheletrico di topi distrofici mdx, quindi sono state trattate aldifuori dell’animale con un vettore virale che trasportava un mini-gene per la distrofina e, successivamente re-iniettate nella vena della coda del topo distrofico. Dopo 7 giorni è stata evidenziata una piccola percentuale di distrofina nei muscoli degli arti posteriori. Questo significava che alcune delle cellule staminali trattate geneticamente erano riuscite in qualche modo ad arrivare nel tessuto muscolare. Alcune cellule erano anche riuscite a migrare, attraverso il flusso ematico in altri organi, incluso il midollo. Etichettando con un gene reporter alcune cellule staminali muscolari purificate, provenienti da topi normali, e re-iniettandole nel topo mdx il cui midollo era stato distrutto, esse erano in grado di differenziare e di cominciare a produrre distrofina nel muscolo scheletrico. Esse, inoltre, riuecivano a trasformarsi anche in vasi sanguigni e tessuto nervoso. Quindi, tali cellule, contribuiscono in vari modi alla rigenerazione di muscolo funzionale e di altri tessuti che normalmente contengono la distrofina che manca invece negli animali distrofici e nei ragazzi Duchenne (Huard, Pittsburg).

Trapianto di mioblasti: Intorno al 1990-1991, sono stati fatti una serie di studi clinici su bambini Duchenne con una tecnica che aveva mostrato qualche risultato positivo sui topi mdx: alcuni mioblasti, i precursori delle cellule muscolari che possono produrre delle cellule muscolari mature, provenienti da un donatore sano e quindi contenenti il normale gene per la distrofina, sono stati iniettati direttamente in vari punti nel muscolo distrofico. Questi esperimenti non hanno avuto successo nei ragazzi Duchenne, perchè i mioblasti non migravano in quantità sufficiente dal sito di iniezione, oltre a questo si verificavano dei problemi immunitari ma, soprattutto, quasi tutti i mioblasti iniettati morivano dopo un breve tempo (Karpati, Montreal).

Terapia genica ex-vivo tramite i mioblasti, primi passi: Isolando i mioblasti da un paziente Duchenne, introducendo in essi il gene corretto per la distrofina e re-iniettandoli si potrebbe probabilmente prevenire la maggior parte dei problemi immunologici. Ma per far si che che una simile terapia genica somatica ex-vivo possa avere una possibilità di successo, bisogna migliorare in modo significativo la sopravvivenza dei mioblasti nel tessuto muscolare dopo il trapianto. Questo potrebbe essere ottenuto facendo si che i mioblasti riescano a sintetizzare, almeno per un certo periodo di tempo, degli agenti anti-infiammatori o dei fattori di crescita. Quindi, bisognerebbe introdurre nei mioblasti, prima del trapianto, dei geni che codifichino per questi agenti. In alcuni esperimenti preliminari è stata usata una elettroporazione per trasportare dei plasmidi contenenti dei geni per una proteina fluorescente attraverso la membrana cellulare di mioblasti umani in coltura. Questa tecnica rende temporaneamente permeabili le membrane con uno stimolo elettrico, ad esempio 400 V attraverso un varco di 4mm. In condizioni ottimali, fino al 70% dei mioblasti vengono trasferiti col gene ed esprimono la proteina marker. L’abilità dei mioblasti a fondersi in miotubi, un altro stadio dello sviluppo muscolare, non viene compromessa. Quindi, le terapie geniche basate sulla correzione del gene e sul trapianto di mioblasti umani potrebbe trarre qualche beneficio dal trasferimento genico tramite elettroporazione (Bernheim, Genève).

Cambiare l’informazione genetica: Sono stati fatti degli esperimenti allo scopo di cambiare l’informazione genetica danneggiata e riparare la mutazione. Questa tecnica avrebbe quattro importanti vantaggi: (1) Potrebbe essere evitato il rischio di un trasferimento mediato da virus. (2) Potrebbe essere riparata non solo la distrofina a livello muscolare ma anche tutte le altre forme. (3) Potrebbe essere mantenuta la regolazione "tessuto-specifica" tipica della distrofina normale. (4) La manipolazione degli agenti terapeutici, gli oligonucleotidi, potrebbe essere più facile ed economica rispetto ai vettori virali che trasportano il materiale genetico. Gli oligonucleotidi sono brevi specifiche sequenze di DNA, formati da pochi nucleotidi e che possono essere creati in modo automatico.

Riparazione del gene: I tentativi di riparare le mutazioni puntiformi a livello del gene sono stati fatti usando alcuni brevi oligonucleotidi chimerici, questi contengono sia RNA che DNA. Il braccio che contiene DNA è perfettamente complementare alla corretta sequenza genica nel sito della mutazione puntiforme del gene, mentre la porzione contenente RNA è perfettamente complementare alla sequenza mutante. Questo porta a strutture quadruplici appaiate, che sono capaci di correggere mutazioni così piccole attivando il meccanismo biologico di riparazione del DNA proprio della cellula. Con questa tecnica, è stato iniettato un DNA-RNA oligonucleotide, complementare al sito della mutazione trovato nel gene della distrofina di cani GRMD, in un cane di 6 settimane affetto da MD. I muscoli trattati hanno mostrato: (1) Evidenza della ricostituzione dell’esone che mancava a causa della mutazione. (2) Ricostituzione della regione della proteina codificata dall’esone mancante compresa la distrofina completa che è stata riscontrata nella sua localizzazione corretta a livello della membrana muscolare. (3) La cosa più importante, inoltre, dimostrava che il gene sul cromosoma X era stato corretto. La riparazione della mutazione si è mantenuta in questo cane per circa un anno. (Bartlett, Bethesda).

Exon skipping: Con questa tecnica si cerca di cambiare una mutazione tipica di una Duchenne in una mutazione tipica delle Becker. Questo può essere fatto inducendo un meccanismo di "splicing", che elimina gli introni dall’RNA-pre-messaggero per eliminare anche uno o più esoni specifici in modo che l’informazione genetica oltrepassi un mutazione puntiforme oppure che venga ripristinato il "frame" di lettura intorno ad una delezione genomica che provoca una lettura "out-of-frame". Il gene con la sua mutazione non viene alterato tramite l’exon skipping, ma in questo modo l’RNA messaggero, mRNA, non contiene più l’informazione dell’esone che è stato oltrepassato. Dato che l’mRNA è più corto del normale, anche la distrofina sarà più corta, contiene meno aminoacidi. Se gli aminoacidi mancanti appartengono alla regione centrale della distrofina, essi non sono fondamentali, la proteina risultante può ancora assolvere il suo compito di stabilizzare la membrana della fibra muscolare. Il risultato di questo processo potrebbe condurre a trasformare una forma Duchenne in una forma più leggera del tipo Becker.

Exon skipping spontaneo: Un ragazzo Duchenne con una delezione nell’esone 45 era ancora in grado di camminare all’età di 14 anni. Quando aveva circa 18 mesi, era stato sottoposto ad un trapianto ed aveva ricevuto cellule staminali del midollo dal padre, perchè in quel momento era affetto da SCID (severe combined immuno deficiency). Questo ha sollevato la questione se le sue cellule muscolari contenessero o meno distrofina normale costruita tramite l’informazione genetica proveniente dalle cellule staminali sane del midollo di suo padre. Le ricerche su nuovo materiale bioptico, tuttavia, hanno ora mostrato che i sintomi più lievi non dipendevano dal trapianto ma da un exon skipping causato dalla speciale natura della sua delezione. Inoltre, le sue cellule muscolari contengono alcuni nuclei cellulari che provengono dalle cellule del padre che attualmente continuano a produrre livelli molto bassi di distrofina normale. Quindi, le cellule del midollo contribuiranno certamente alla riparazione della fibra muscolare, ma non in maniera sufficiente ad alterare il corso della malattia in modo significativo (Kunkel, Boston).

Ricombinazione omologa: La mutazione puntiforme nel gene della distrofina nel topo mdx potrebbe essere riparata nel 15-20% di mioblasti isolati tramite addizione di un segmento di DNA di 603 nucleotidi con la corretta sequenza al sito di mutazione. Parte del nuovo segmento del gene è stato scambiato con un segmento omologo contenente la mutazione da C a T nell’esone 23 del topo. Questa tecnica di ricombinazione di un breve frammento omologo (short fragment homologous recombination, SFHR) ora viene applicata ai mioblasti isolati da pazienti Duchenne con delezioni negli esoni da 45 a 51 e 13. Se si mostrerà efficace questa tecnica potrà riparare il disturbo nella lettura del frame e quindi permetterà la reintroduzione di mioblasti corretti nel muscolo dello stesso paziente (Kapsa, Melbourne).

Ignorare uno stop codon tramite l’uso di antibiotici: Circa un 5% di ragazzi Duchenne hanno una mutazione puntiforme nel loro gene per la distrofina che ha trasformato il codice di un aminoacido in uno dei tre tipi di stop codons, TGA, TAG and TAA, quindi, dopo la trascrizione in mRNA, la sintesi di distrofina si ferma prematuramente. La gentamicina è un antibiotico che fa si che il meccanismo di traslazione dell’RNA nei ribosomi ignori tali stop codons prematuri. Mentre i normali stop codons, che sono protetti da una speciale struttura tridimensionale, mantengono la loro normale funzionalità.

Attivazione dell’utrofina: L’Utrofina è una proteina simile alla distrofina. Nell’uomo, il suo gene è situato sul cromosoma 6, ha molti esoni come il gene della distrofina e contiene circa 1 milione di nucleotidi. La proteina utrofina è circa un 7% più corta della distrofina ma ha una struttura ed una funzione molto simile. Essa è presente in molti tessuti, anche nel muscolo, ma si concentra particolarmente alle giunzioni neuromuscolari, le regioni in cui i nervi motori entrano in contatto con la membrana muscolare. Prima della nascita, la concentrazione di utrofina nel muscolo è più alta. Questa proteina, anche quando è presente solo in piccole quantità, riesce ad alleviare i sintomi della distrofia Duchenne. Infatti i topi mdx, nei quali il gene dell’utrofina è stato bloccato artificialmente (knocked out), i quali quindi non hanno nè distrofina nè utrofina, presentano sintomi molto gravi rispetto ai normali topi mdx i cui muscoli neanche degenerano.

Sintrofina: Le cinque forme di sintrofina conosciute sono proteine che mediano l’interazione di proteine segnalatrici con il complesso della distrofina e dell’utrofina a livello della membrana della cellula muscolare. Gli studi su topi che mancano di a-sintrofina suggeriscono che questa forma partecipi sia nella regolazione della sintesi dell’utrofina sia nell’assemblaggio del complesso dell’utrofina nella membrana della cellula muscolare. Comprendere questi effetti fin nei dettagli potrebbe rislutare utile nel cercare una terapia della distrofia tramite l’utrofina (Froehner, Chapel Hill).

Sovraregolazione dell’Integrina: Ci sono un certo numero di integrine, proteine che connettono le fibre muscolari fra loro e con la lamina basale che le circonda e che partecipano anche alla trasmissione di segnali da una cellula all’altra. I pazienti Duchenne e Becker hanno una quantità maggiore di α7β1-integrina rispetto alla norma ed è stato suggerito che questo possa rallentare la malattia. Nei topi gravemente distrofici che non hanno nè distrofina nè utrofina, la catena a7 dell’integrina che proveniva da ratti era espressa nei topi transgenici con il promoter creatin kinasi come attivatore e conduceva ad una maggiore quantità della subunità β1. Questa manipolazione genetica ha aumentato l’α7β1-integrina di due o tre volte rispetto alla norma, con la conseguenza di estendere la longevità dei topi di circa tre volte, ridurre la cifosi, mantenere la mobilità e la struttura delle giunzioni neuromuscolari.

Leupeptina: Questo è un tripeptide, che consiste di tre aminoacidi, che inibisce l’enzima calpaina. La calpaina distrugge le proteine quando il calcio entra in modo incontrollato nelle fibre muscolari, come avviene nella distrofia Duchenne e in altre malattie neuromuscolari. Collegando la leupeptina con la carnitina, l’effetto inibitore è addirittura maggiore. In esperimenti con scimmie e topi la degenerazione muscolare è stata inibita. Per il 2002 sono pianificati dei trials su pazienti. Il farmaco può essere somministrato oralmente piuttosto che per iniezione. E’ possibile che anche la degenerazione muscolare tipica di altre malattie possa essere influenzata da questo trattamento (Stracher, Brooklyn).

Stabilizzatori di membrana: La sostanza sintetica Polaxamer 188 (P188), che condivide molte delle proprietà chimiche delle membrane, è stata usata per stabilizzare i globuli rossi in un tipo di anemia e per prevenire danni al muscolo cardiaco durante un arresto cardiaco. Dato che la mancanza di distrofina porta ad un danno fisico della membrana muscolare, il p188 potrebbe essere usato per proteggere le fibre muscolari dall’effetto delle stress fisico. Sono in corso delle sperimentazioni sui topi mdx (Quinlan, Cincinnati).

JNK1: In topi senza distrofina e senza la proteina muscolare MyoD, viene attivata la proteina di segnale JNK1 e provoca l’apoptosi, un suicidio della cellula, che porta alla degenerazione delle cellule nella distrofia Duchenne. Questo effetto deleterio è dovuto alla inattivazione della proteina muscolare NFATc1. L’iniezione diretta nel muscolo della proteina inibitore JIP1, inserita in un adenovirus, ha rallentato in maniera estremamente significativa la distruzione delle fibre. Attualmente, dei peptidi specifici, cioè piccoli pezzi di proteine, diretti contro la proteina JNK1 sono allo studio come una possibile terapia per fermare la degenerazione del muscolo nella Duchenne (Megeney, Ottawa).

Ossido nitrico sintasi: Nei topi mdx e nei pazienti Duchenne, la quantità di enzima NOS, nel complesso di membrana della distrofina è enormemente ridotta e addirittura il prodotto di quest’enzima, l’ossido nitrico, un gas biologicamente attivo, non riesce a svolgere le sue molteplici funzioni ed la sua assenza favorisce la degenerazione del muscolo. Un topo transgenico mdx con la normale quantità di Ossido Nitrico Sintasi ha mostrato una marcata riduzione dei segni tipici della patologia, come ad esempio l’infiammazione, le lesioni della membrana e l’attività della creatin kinasi. Un trial clinico per testare l’efficienza di farmaci anti-infiammatori nei pazienti Duchenne è in corso (Tidball, Los Angeles).

Aumento della rigenerazione muscolare: Dal momento che è conosciuto che la proteina insulin-like growth factor (IGF-1), è in grado di aumentare la sintesi proteica, sono stati fatti degli esperimenti per determinare se essa potesse essere usata per migliorare la rigenerazione nel muscolo distrofico. Sono stati creati dei topi distrofici che producessero questo fattore in quantità abbastanza significative nei loro tessuti muscolari, chiamati strophic muscle insulin-like growth factor 1, mIGF1. La massa muscolare di questi topi transgenici è aumentata di almeno il 40%, la fibrosi e il normale deterioramento muscolare riscontrabile nel diaframma di topi mdx anziani e nei loro quadricipiti, era sensibilmente ridotta e la rigenerazione del muscolo notevolmente aumentata (Rosenthal, Roma).

Trasformare la pelle in muscoli: La proteina galectina-1 si trova nel muscolo scheletrico e nei suoi precursori cellulari, mioblasti e miotubi, e partecipa nei processi che conducono ad un nuovo tessuto muscolare. Si è visto che i fibroblasti, che sviluppano in tessuto connettivo, possono essere trasformati in fibre muscolari se vengono cresciuti in colture cellulari contenenti galectina-1. I fibroblasti sono stati ottenuti dalla pelle di topi neonati e feti umani. I lavori stanno proseguendo e si cerca di determinare quali siano le condizioni ideali per poter utilizzare fibroblasti provenienti da tessuti muscolari maturi. Questi fibroblasti potrebbero essere prelevati facilmente da un paziente Duchenne, potrebbero essere trasfomati in muscolo tramite la galectina-1, quindi modificati geneticamente per sintetizzare una distrofina normale e quindi trapiantati di nuovo nel paziente (Watt, London).

Glucocorticoidi, steroidi: Sedici studi clinici in tutto il mondo hanno dimostrato l’efficienza dei derivati del cortisone, specialmente prednisone, nel ridurre la perdita di forza muscolare nei ragazzi Duchenne. Quindi ci sono state indicazioni di un nuovo cortisonico, il deflazacort, che aveva una azione simile ma minori effetti collaterali. Dal 1992 al 1997, è stato fatto uno studio con la partecipazione di 14 centri in Germania, in questo studio sono stati comparati gli effetti, nel mantenere la forza muscolare, di due farmaci simili e rispetto al normale decorso della malattia. Le dosi utilizzate sono state 0.75 mg per kg di peso per giorno per il prednisone e 0.9 mg per kg e per giorno per il deflazacort. Entrambi i farmaci possono mantenere la forza per almeno due o tre anni ed in casi isolati, possono prolungare la capacità di camminare oltre i 14 anni. Il più grave effetto collaterale del prednisone è l’aumento di peso, (circa il 20% dei pazienti). Con il deflazacort, ci sono stati rischi moderati di cataratta (appannamento della lente dei nostri occhi) più facilmente che con il cortisone. Entrambi i farmaci hanno avuto un effetto ritardante sulla crescita, altri effetti sono stati insignificanti. Una volta interrotto il farmaco, la degenerazione muscolare riprendeva e la crescita tornava alla norma.

Creatina: Un'altra sostanza che forse può rallentare la degenerazione muscolare è la creatina, un composto naturale che è utilizzato in grande quantità dagli atleti per migliorare le proprie prestazioni. La creatina nella sua forma fosforilata, fosfocreatina, fornisce energia non solo per la contrazione muscolare ma anche per la rimozione del calcio superfluo, una delle cause della distruzione delle fibre muscolari. Le sperimentazioni con i topi mdx hanno mostrato che la creatina migliora la salute del muscolo e può fornire una base scientifica che ne giustifichi l’utilizzo come integratore nella Duchenne (Wallimann, Zürich; Rüegg, Lausanne).

Studi clinici: Studi clinici con ragazzi Duchenne saranno ancora sempre più necessari in vista dell’aumento di risultati incoraggianti nelle sperimentazioni animali. Dopo l’insuccesso del trapianto di mioblasti iniziato nei pazienti Duchenne nei primi anni 90, i ricercatori sono ora molto cauti nella pianificazione di queste sperimentazioni. Gli studi clinici che vengono pianificati devono essere condotti attraverso fasi successive, delle quali la prima, fase I, richiede già alcuni anni e consiste nella dimostrazione che il nuovo trattamento non sarà accompagnato da effettio collaterali indesiderabili. Solo successivamente, ulteriori studi possono accertare se il trattamento sia realmente in grado di migliorare o mantenere la forza muscolare, fase II, e quali siano le dosi ottimali, fase III. Praticamente tutti questi studi devono essere condotti come trials doppio cieco, cioè una metà dei pazienti riceve la sostanza che deve essere sperimentata mentre l’altra metà riceve un placebo, un composto inattivo, e nè il paziente nè il medico che somministra il farmaco conoscono i gruppi di appartenenza dei pazienti fino a che il trial non sia concluso ed i risultati non siano stati esaminati. Questi studi e le procedure di approvazione portano via una grande quantità di tempo, inoltre sono enormemente costosi. Tuttavia ci sono esempi di trattamenti che raggiungono in breve i pazienti come il Gleevec, il farmaco che è stato approvato nel 2001 in pochi mesi senza prenderne in esame tutti gli effetti collaterali dal momento che era stato dimostrato che esso era in grado di curare circa il 90% dei pazienti affetti da leucemia mieloide cronica.

Controllo delle CK: In Germania, bambini in età presintomatica (da 1 a 6 mesi di età), affetti da Duchenne e Becker, possono essere diagnosticati in un programma di screening volontario delle CK, in cui viene misurata la quantità di enzima creatin kinasi in una goccia di sangue. Dal 1974, più di 500,000 neonati sono stati esaminati e sono stati diagnosticati 130 ragazzi affetti da Duchenne (1:3,800) e 28 affetti da Becker (1:17,900). Questi programmi saranno necessari in futuro, perchè i progressi nella ricerca terapeutica porteranno a studi su pazienti molto piccoli che non mostrano segni clinici e i cui muscoli sono ancora per lo più intatti. Un futuro trattamento sarà probabilmente in grado di fermare o di ritardare il processo distrofico, ma non di rimpiazzare il tessuto già perso (Scheuerbrandt, Breitnau/Freiburg).

Quando ci sarà una terapia? La distrofia Duchenne è sempre esistita negli uomini e negli animali che hanno il muscolo scheletrico. E’ stata descritta correttamente per la prima volta nel 1851 dal medico inglese Edward Meryon. Tuttavia, deve il suo nome al medico francese Duchenne de Boulogne, che descrisse nel 1861, non solo i sintomi, ma anche la sua istologia. Le modalità della sua ereditarietà, sono state scoperte intorno all’inizio del 20° secolo, quando fu riconosciuto un possibile difetto sul cromosoma X. Solo nel 1986 è stato identificato il gene responsabile della malattia, il gene della distrofina, (Kunkel, Boston) e poco dopo fu caratterizzata la proteina stessa, (Hoffman, Washington), che manca nei ragazzi Duchenne. Il rapido sviluppo della ricerca genetica ha dato speranze che presto si sarebbe potuto rimpiazzare o riparare il gene e quindi curare la malattia.