Il apparaît raisonnable de penser que le transfert, le transport, de quantités suffisantes du gène intact de la dystrophine dans les noyaux de cellules de muscle dystrophique pourrait guérir de la maladie. Il faut pour cela que l'information génétique des nouveaux gènes soit utilisée par les ribosomes effectuant la synthèse des protéines pour produire des quantités assez grandes de dystrophine fonctionnelle, qui doit ensuite migrer vers son emplacement normal sous la membrane cellulaire, pour être incorporée normalement dans le complexe serré dystrophine-glycoprotéine des costamères.

   La souris dystrophique: La majorité des expériences de transfert de gènes se font avec un type d'animal de laboratoire: la souris mdx dystrophique, qui porte une mutation ponctuelle sur le nucléotide 3185 dans l'exon 23 de son gène de la dystrophine. Cette mutation a changé un codon CAA, qui signifie l'acide aminé glutamine, en un codon TAA, qui est un codon stop, de sorte que la synthèse de la dystrophine s'arrête prématurément et que la souris n'a pas de dystrophine fonctionnelle dans ses muscles. Toutefois, ces souris ne perdent pas leurs muscles car elle ne développent pas de fibrose, une prolifération du tissu conjonctif, comme les garçons atteints de la maladie de Duchenne, si bien que les processus dégénératifs causés par la maladie ne l'emportent pas sur la régénération.
   Bien que le transfert de gènes puisse être étudié chez ces souris, il faut se souvenir que les résultats obtenus avec ces souris ne peuvent pas être considérés comme applicables aux enfants sans que l'on fasse des études cliniques sur des patients atteints de la maladie de Duchenne. Un enfant n'est pas une grande souris!

   Le chien dystrophique: Certaines expériences ont été faites chez le chien dystrophique, le chien GRMD (golden retriever muscular dystrophy), qui, contrairement à la souris, présente une dystrophie musculaire semblable à la dystrophie de Duchenne. Ces chiens sont vraiment handicapés et donc difficiles à élever et à conserver. Leur gène de la dystrophine porte une mutation ponctuelle dans le site récepteur d'épissage de l'intron 6, ce qui entraîne une délétion de l'exon 7 dans l'ARNm, un déplacement du cadre de lecture et un codon stop prématuré.

   Transfert de gènes avec des adénovirus: Pour que l'on puisse transférer un gène, il faut un transporteur, un vecteur de gène. Une façon de transférer du matériel génétique dans des cellules vivantes consiste à l'emballer dans des virus qui sont composés d'un ruban de leurs propres gènes enveloppés dans une enveloppe protéique. Ils s'attachent à la surface d'une cellule vivante, introduisent leurs gènes dans la cellule et utilisent ensuite le propre appareil de synthèse de la cellule pour se reproduire.
   Dans la recherche sur la maladie de Duchenne, on utilise essentiellement deux types de virus comme vecteurs de gènes, l'adénovirus et le virus adéno-associé, dix fois plus petit. Ces virus ne peuvent plus se multiplier à l'intérieur des cellules cibles car les scientifiques ont éliminé presque tous leurs gènes. Le virus le plus avantageux semble être l'adénovirus évidé, pratiquement vide, qui ne contient aucun de ses propres gènes et a donc de la place pour près de 36.000 lettres génétiques étrangères, suffisantes pour coder tout l'ADNc contenant l'information entière de la protéine dystrophine. Avec ces virus évidés, de la dystrophine nouvelle a été synthétisée dans près de 30% des fibres musculaires d'une souris dystrophique, phénomène qui a été suivi d'une amélioration de la fonction musculaire tant chez la souris jeune que chez la souris plus âgée. (Lochmüller, Munich; Chamberlain, Seattle).

   Deux gènes dans le même virus: Dans des expériences récentes, deux ADNc de dystrophine de souris ont été introduits dans chacun des virus évidés, c'est-à-dire deux fois l'ensemble des 79 exons sans les introns, ainsi que deux séquences géniques supplémentaires, le très puissant promoteur du cytomégalovirus et le promoteur de la béta-actine. Ces vecteurs ont été injectés dans le muscle tibial antérieur de souris mdx nouveau-nées et de jeunes souris âgées de 4-6 semaines. Au bout de 30 jours, 42 % des cellules du muscle traité des souris nouveau-nées avaient de la nouvelle dystrophine qu'on pouvait encore détecter 6 mois plus tard. Chez les jeunes souris, 24 % des cellules musculaires avaient de la nouvelle dystrophine au bout de 30 jours, dont la quantité avait cependant diminué de moitié au bout de 6 mois. Seules les jeunes souris ont eu de légers problèmes immunitaires. A l'heure actuelle, ces nouveaux vecteurs sont les vecteurs les plus efficaces pour le traitement de la dystrophie musculaire de Duchenne par thérapie génique (Karpati, Montréal).

   Transfert de gènes avec les virus adéno-associés: Les petits virus adéno-associés peuvent uniquement transporter du matériel génétique qui ne dépasse pas 5.000 nucléotides environ, ce qui correspond à un tiers de l'ADNc complet de la dystrophine. Leur avantage réside dans le fait qu'ils transfèrent le gène plus efficacement que l'adénovirus normal. Le désavantage est le fait que l'ADNc à transférer doit être considérablement raccourci de façon à pouvoir se loger dans ce petit vecteur. Les patients souffrant de la dystrophie musculaire de Becker, qui progresse beaucoup plus lentement que la dystrophie de Duchenne, ont dans leurs muscles une dystrophine raccourcie de la sorte. Par conséquent, une éventuelle thérapie génique transférant l'un de ces mini-gènes de Becker ne guérirait pas complètement la dystrophie musculaire de Duchenne, mais la transformerait en la forme de Becker, bénigne.
   Afin de déterminer lesquelles des quatre régions de la protéine de dystrophine normale sont importantes - les deux extrémités, la région riche en cystéine ou le bâtonnet central, des expériences approfondies ont été effectuées, dans lesquelles des souris dystrophiques ont été génétiquement modifiées de façon à exprimer dans leurs muscles l'une des neufs différentes dystrophines raccourcies.
   L'on savait déjà qu'une partie de la région centrale en forme de bâtonnet pouvait être éliminée sans perte de fonction. L'analyse détaillée de la structure tridimensionnelle a révélé maintenant quelles parties spécifiques de la structure en forme de bâtonnet peuvent être détruites sans perte significative de la fonction de protection du muscle. L'une des dystrophines raccourcies, qui avait à peu près la moitié de la longueur de la protéine normale, avait pratiquement les mêmes propriétés que la protéine intacte. Le transfert de ce gène de dystrophine raccourcie et de certains autres, au moyen de virus adéno-associés dans les muscles de souris mdx a prévenu, et en partie éliminé, les symptômes de la dystrophie. Ces résultats ont montré que des modifications spécifiques de la dystrophine pouvaient générer de nouvelles protéines qui sont significativement plus petites, mais plus fonctionnelles, que les dystrophines raccourcies naturellement des patients atteints de la dystrophie musculaire de Becker (Chamberlain, Seattle).
   Si 30% environ de la quantité normale de dystrophine intacte réapparaissent, des mesures effectuées sur le diaphragme de souris indiquent que la fonction musculaire s'améliore aussi. De même, le transfert du mini-gène entraîne une amélioration de la fonction musculaire. En outre, ces expériences ont montré que le transfert de gènes donne de meilleurs résultats chez l'animal jeune car il y a moins de problèmes de rejet immunitaire et, après une injection unique, la dystrophine néo-synthétisée reste plus longtemps dans les muscles que chez l'animal adulte. Après une application unique à des souris nouveau-nées, la dystrophine néo-synthétisée peut encore être détectée une année plus tard.
   Dans la perspective d'une application future à l'homme, cela signifie que les patients devraient être traités dès que possible après la naissance, lorsque leurs muscles sont encore largement intacts (Clemens, Pittsburgh).

   Transfert de gène par la voie de la circulation sanguine: Dans les expériences décrites jusqu'ici, des solutions de virus contenant le gène de la dystrophine étaient injectées directement dans les muscles de l'animal. Pour que tous les muscles, même ceux du cœur et des poumons, puissent être atteints, des expériences sont en cours visant à développer un traitement systémique, c'est-à-dire un traitement offrant la possibilité d'injecter les virus dans la circulation sanguine. Afin de s'assurer que la nouvelle dystrophine n'est synthétisée que dans les cellules musculaires, l'on ajoute une autre séquence génétique au gène de la dystrophine dans le virus, le promoteur de la CK, long de 1.354 nucléotides qui active normalement le gène d'une protéine musculaire, la créatine kinase. Ce promoteur garantirait que le nouveau gène de la dystrophine est activé uniquement dans les cellules musculaires et non ailleurs.
   Pour étudier si de telles stratégies donneraient des résultats chez l'animal vivant, on a créé des souris mdx transgéniques qui possédaient un gène supplémentaire inséré dans leurs chromosomes. Il s'agissait d'un gène de la dystrophie de Becker souvent utilisé qui, avec ses 6.300 nucléotides, a la moitié de la longueur d'un gène normal et qui était précédé par un promoteur de la CK contenant 1.354 nucléotides. De la dystrophine raccourcie a alors été présente durant toute la vie des souris, soit jusqu'à 24 mois, ceci en quantités suffisantes pour améliorer tous les symptômes cliniques mesurables.
   La nouvelle protéine n'est apparue que dans les muscles des souris transgéniques, nettement plus dans les muscles rapides que dans les muscles lents. Les muscles rapides, qui travaillent immédiatement mais pas de façon continue, obtiennent leur énergie de la glycolyse, c'est-à-dire de la dégradation rapide du glucose qui n'utilise pas d'oxygène. L'énergie des muscles lents qui travaillent continuellement provient des enzymes de la chaîne respiratoire, "l'oxydation" lente des substances organiques par l'oxygène. Comme les muscles rapides sont les premiers détruits par la dystrophie musculaire, la présence prédominante de nouvelle dystrophine dans ces muscles rapides permet justement d'améliorer cette première conséquence de la maladie. Des tests ont montré que seuls 20 à 30% de la quantité normale de dystrophine avaient une activité thérapeutique notable.
   Pour ces expériences avec des souris transgéniques, on a introduit le gène de la dystrophine de Becker avec le promoteur de la CK dans les cellules germinales par insémination artificielle et manipulation génétique, de sorte qu'on le retrouve dans le patrimoine génétique transmis à la descendance de ces souris. Cette technique ne peut évidemment être appliquée à l'homme. Pour soigner les enfants malades, il faudrait pouvoir transporter le gène avec son promoteur par une technique de transplantation génique au moyen d'un vecteur juste après la naissance et dans tous les muscles, si possible (Lochmüller, Munich).

   Amplification du transfert de gène désiré: Les virus se lient à des structures spécifiques sur la membrane cellulaire, les récepteurs de coxsackie et des adénovirus, à partir desquels ils pénètrent ensuite, à travers la membrane, à l'intérieur de la cellule musculaire. Toutefois, ces récepteurs sont plus nombreux sur les cellules en phase de développement ou de régénération. A l'inverse, ils sont réprimés, moins nombreux, dans les muscles arrivés à maturité qui ne se divisent plus. Ainsi, le transfert de gènes au moyen de vecteurs adénoviraux est plus efficace dans les cellules musculaires qui se divisent.
   Pour surmonter ce handicap, on a produit des souris transgéniques qui expriment ces récepteurs en grand nombre à la surface des fibres musculaires matures. Le résultat a été un transfert 10 fois plus efficace du gène de la dystrophine (Holland, Montreal; Lochmüller, Munich).
   Comme on ne pouvait multiplier les récepteurs à virus sur les cellules musculaires d'un patient que par d'autres techniques géniques, on a, au vu des risques, produit des protéines "helper". Dans ce cas, il s'agissait d'anticorps monoclonaux faits d'une seule sorte de molécules pouvant se lier très spécifiquement, par une de leurs extrémités, à d'autres récepteurs plus nombreux. Par leur autre extrémité, ces protéines du système immunitaire pouvaient se lier aux protéines enveloppes modifiées des adénovirus. Pour réaliser cette liaison, il a fallu introduire dans les adénovirus, par manipulation génétique, une information supplémentaire pour une chaîne de 33 acides aminés provenant d'une bactérie.
   Ces adénovirus ont alors pu se fixer, par l'intermédiaire du pont d'anticorps, sur les récepteurs de l'intégrine et des nerfs (NCAM) qui étaient bien plus nombreux que les adénorécepteurs. Cette méthode a permis le passage de 77 fois plus d'adénovirus dans la cellule musculaire au travers de la membrane que précédemment. Avec cette nouvelle technique, qu'on peut utiliser aussi contre d'autres maladies, on n'a transporté que le gène qui produit la béta-galactosidase, une protéine facilement détectable. Des expériences de transfert du gène de la dystrophine sont en préparation (Kochanek, Cologne).

   Transfert de gènes nus: Dans cette technique, le matériel génétique, l'ADN, à transférer n'est pas incorporé dans un virus, mais dans des plasmides, qui sont de petites structures d'ADN circulaire dépourvues de protéines, que l'on trouve parfois en grandes quantités dans les bactéries, où elles confèrent principalement la résistance aux antibiotiques. L'avantage de ce type de transfert de gènes réside dans le fait que les plasmides ne contiennent pas de protéines mais uniquement du matériel génétique, de l'ADN nu, de sorte qu'aucune réaction immunitaire ne se développe contre le matériel du vecteur.
   Des expériences ont été faites avec des plasmides contenant des gènes marqueurs ou rapporteurs, des gènes dont les protéines peuvent être détectées dans le tissu musculaire par coloration ou par production de lumière, de sorte qu'il est facile de contrôler si une expérience de transfert a réussi.
Lorsque des volumes relativement grands d'une solution de ces plasmides ont été injectés sous pression dans les artérioles des membres de rats et de singes rhésus, les gènes rapporteurs beta-galactosidase et luciférase ont été transférés dans près de 20% des fibres musculaires après une seule injection et dans près de 40% des fibres musculaires après des injections répétées. La pression a été produite en bloquant l'efflux de sang veineux d'un membre pendant une brève période. Des expériences de transfert du gène de la dystrophine chez la souris mdx, le singe et le chien GRMD sont actuellement en cours (Wolff, Madison; Braun, Strasbourg). En France, des études cliniques avec des garçons souffrant de la maladie de Duchenne ont débuté. Elles sont décrites sous "Etudes cliniques".

   Expériences effectuées pour surmonter les problèmes immunologiques: L'ADN sous forme de plasmide ne contenant pas de protéines, le transfert de gènes au moyen de ces ADN nus permet aussi d'examiner les éventuels problèmes de réponses immunitaires à la nouvelle dystrophine créée sans qu'il y ait d'interférences de la part d'autres protéines, qui sont introduites lorsque l'on utilise d'autres méthodes de transfert de gènes au moyen des vecteurs viraux et cellulaires.
   Des études sur la souris mdx ont montré que des réponses immunitaires étaient générées contre la dystrophine humaine mais non contre la dystrophine de souris, malgré l'absence de dystrophine normale dans les muscles de la souris. L'absence de réponse immunitaire contre la dystrophine de souris peut avoir été due à la présence d'autres formes de dystrophine. Ces résultats suggèrent que les réponses immunitaires au transfert de gène de la dystrophine ne représentent peut-être pas un problème particulier chez les patients atteints de la dystrophie de Duchenne, en particulier chez ceux qui portent des mutations ponctuelles qui n'interfèrent pas avec la synthèse des autres formes de dystrophine. Le travail expérimental actuel vise à déterminer laquelle des autres dystrophines doit être présente pour permettre une tolérance immunitaire à l'apparition d'une nouvelle dystrophine de type musculaire après transfert de gène (Wells, Londres).

   Cellules souches de muscles squelettiques: A la surface des cellules musculaires, on trouve des cellules satellites, appelées aussi "cellules myogéniques" ou "myoblastes", qui, après avoir subi une activation en plusieurs stades intermédiaires, sont capables de former de nouveaux muscles ou de réparer des muscles endommagés. Pour déterminer si ces cellules dites "de sûreté" sont des cellules souches en partie ou en totalité, des cellules satellites des muscles squelettiques de souris nouveau-nées ont été isolées. On a trouvé qu'elles étaient de trois types, dont surtout les cellules myogéniques appelées EP et LP qui sont déjà très spécialisées. Celles du troisième type sont les muscle derived stem cells (cellules souches du muscle) ou MDSC. Elles sont très rares, une seule cellule MDS sur 100.000 cellules satellites. Mais ces cellules rares sont pluripotentes, c'est-à-dire qu'elles peuvent se différencier en cellules musculaires aussi bien qu'en cellules nerveuses ou en cellules pariétales pour des nouveaux muscles. Enfin, elles peuvent être mises en culture pendant longtemps.
   Ces cellules MDS ont été multipliées en laboratoire et 400.000 d'entre elles injectées en un bolus de 25 microlitres (1/40 de centimètre cube) dans un muscle de souris mdx vivantes. Afin de déterminer en quoi les cellules EP plus spécialisées diffèrent des cellules myogéniques normales, les premières ont aussi été injectées à des souris mdx dans les mêmes conditions.
   Chez les souris traitées avec les cellules EP, 130 muscles contenaient de la nouvelle dystrophine au site d'injection au bout de 30 jours, mais après 90 jours, celle-ci avait en grande partie disparu. Chez ces souris, on a constaté un rejet immunitaire par les lymphocytes, probablement responsable de la disparition progressive de la nouvelle dystrophine.
   Contrairement aux résultats ci-dessus, 1.500 cellules musculaires traitées avec des cellules MDS contenaient de la nouvelle dystrophine au site d'injection, en quantité 10 fois supérieure à celle qui a résulté de l'injection de cellules EP. Même au bout de 90 jours, la nouvelle dystrophine était encore présente dans toutes ces cellules pratiquement. Dans ce cas, il n'y a eu aucun rejet immunitaire, bien que les souris réceptrices n'aient reçu aucun traitement immunosuppresseur.
   Comme les cellules souches utilisées dans ces expériences ont été prélevées sur des souris nouveau-nées normales, cette technique ne pourra probablement pas être appliquée telle quelle aux enfants atteints de la dystrophie musculaire de Duchenne. Ces résultats pourraient avoir toutefois une influence sur les essais sur les myoblastes repris récemment (Huard, Pittsburgh; Wernig, Bonn).

   Cellules souches de moelle osseuse, de muscles et de peau: La fin de la dernière décennie a vu les premiers essais conduits avec des cellules souches de moelle osseuse et des cellules satellites de muscle. Dans toutes ces expériences, les cellules souches ont été extraites de souris mâles normales avec des gènes normaux de la dystrophine et injectées dans la veine caudale de souris mdx femelles. Celles-ci étaient homozygotes, c'est-à-dire que les gènes de dystrophine de leurs deux chromosomes X portaient une mutation qui les empêchait de produire leur propre dystrophine. Le devenir des cellules injectées a pu être suivi par la détection du chromosome mâle Y. Les souris femelles durent recevoir des doses létales de rayons X pour prévenir toute réaction immunitaire. Le transfert de cellules souches a régénéré la moelle épinière des souris.
   Pour commencer, on a injecté 10 à 50 millions de cellules provenant de moelle osseuse non traitée. Trois mois plus tard, on a pu détecter de la dystrophine dans près de 10 % des cellules musculaires des souris. Certaines cellules contenant cette dystrophine contenaient aussi des chromosomes Y, preuve que les cellules de moelle osseuse provenant des souris mâles normales étaient venues au travers de la circulation sanguine et avaient fusionné avec les cellules musculaires des souris mdx. Ces cellules avaient amené avec elles l'information pour la dystrophine normale qui a ensuite servi à la production de dystrophine fonctionnelle. Il était important de prouver que la nouvelle dystrophine n'était pas le résultat d'une réversion, c'est-à-dire de l'omission spontanée d'un exon, ce qui arrive parfois chez les souris mdx ainsi que chez les garçons victimes de la dystrophie musculaire de Duchenne.
   Pour déterminer quelle partie des cellules de moelle osseuse a les propriétés des cellules souches, on a pu isoler une petite population de cellules excluant le colorant Hoechst 33343, ou population SP, du mélange cellulaire originel en utilisant la méthode dite FACS, pour fluorescence-activated cell sorting. Comme ces cellules SP avaient des propriétés de cellules souches, elles ont été utilisées à d'autres expériences. Trois mois après injection de seulement 2.000 à 5.000 de ces cellules SP de moelle osseuse, près de 4 % des cellules musculaires des souris mdx avaient de la dystrophine fonctionnelle. De la même manière, on a isolé des cellules souches musculaires SP dans des cellules musculaires satellites, et 7.000 à 20.000 d'entre elles ont été injectées dans la circulation sanguine de souri mdx femelles. Au bout d'un mois, 5 à 9 % de leurs cellules musculaires contenaient de la dystrophine normale et certaines avaient aussi des chromosomes Y.
   Ces expériences ont été renouvelées en 2002/2003 et étendues à des cellules souches prélevées de la peau. L'avantage de les prendre de la peau est que les tissus cutanés sont plus facilement accessibles que les tissus musculaires et que les animaux récepteurs n'ont plus besoin d'être irradiés.
   Une petite population de cellules excluant le colorant Hoechst 33343 a été obtenue au moyen de la technique FACS à partir de cellules de peau également, qui avaient les mêmes propriétés de surface, les mêmes marqueurs, que les cellules souches musculaires SP. Les pourcentages de cellules SP étaient maintenant de 0,1 % pour celles de moelle osseuse, de 0,7 % pour celles de muscles, et 1,2 % pour celles de peau. Trois mois après l'injection de 6.000 à 50.000 cellules SP de peau, 2,3 % des cellules musculaires de souris femelles contenaient de la nouvelle dystrophine et quelques unes contenaient aussi des chromosomes Y.
   Cette expérience a démontré que des cellules souches pouvaient être isolées de la peau et qu'elles pouvaient, après passage dans la circulation sanguine, former de nouvelles cellules musculaires ayant de la dystrophine normale. Cette technique n'est pas encore suffisamment efficace pour constituer une thérapie utile, mais après optimisation, il devrait être possible de baser sur elle une thérapie de la dystrophie musculaire de Duchenne (Kunkel, Boston).

   Activation de cellules souches musculaires: les cellules souches avec des structures de surface spécifiques qui se trouvent dans des muscles intacts, ne se sont pas développées en nouvelles cellules musculaires, elles n'étaient pas myogéniques. Mais si les muscles étaient endommagés et si les cellules musculaires se régénéraient d'elles-mêmes, alors le nombre de cellules souches pouvait augmenter jusqu'à 10 fois. Ces cellules étaient alors myogéniques, elles se transformaient en myoblastes et en nouvelles cellules musculaires, comme l'ont montré des expériences sur des cultures cellulaires et des souris. Cette activation était déclenchée par les protéines Wnt, une famille de protéines transmetteurs de signaux qui semblent produites par les cellules des muscles lésés et qui jouent aussi un rôle au cours du développement embryonnaire (Rudnicki, Ottawa).
   Plusieurs protéines Wnt ont maintenant été isolées et caractérisées. Elles ont une longueur d'environ 400 acides aminés et contiennent de l'acide palmitique, un acide gras qui semble jouer un rôle important dans la transmission des signaux moléculaires (Nusse, Stanford).

   Mésoangioblastes, les cellules souches des vaisseaux sanguins: Un demi million de cellules souches récemment détectées dans les vaisseaux sanguins de fœtus de souris normales ont été injectées en une fois dans l'artère de pattes arrières de souris. Ces souris étaient dépourvues d'une protéine du complexe de la dystrophine, l'alpha sarcoglycane responsable chez l'homme d'une des nombreuses dystrophies des ceintures. Une fois injectées, les cellules ont migré dans les capillaires sanguins, traversé leurs parois cellulaires et de là, pénétré dans tous les muscles de la patte ayant reçu l'injection, surtout dans les fibres en régénération.
   Dans les trois mois au moins qui ont suivi l'injection, du nouveau sarcoglycane a été présent en quantités presque normales à nouveau. Il en a été de même pour les nombreuses autres protéines du complexe de la dystrophine également manquantes précédemment. Il n'y a pas eu de réaction de rejet non plus. Après trois injections consécutives à 40 jours d'intervalle, non seulement le défaut du gène était presque entièrement corrigé, mais la force musculaire de la patte traitée était à nouveau pratiquement normalisée. Ici aussi, on n'a eu aucun problème de rejet.
   Pour vérifier si cette technique pouvait être éventuellement employée dans la thérapie génique, on a isolé les mésoangioblastes de souris "malades" et le gène de l'alpha sarcoglycane manquant a ensuite été transféré au moyen de rétrovirus dans ces cellules souches déficientes. L'application systémique de ces cellules traitées ex vivo a donné les mêmes résultats positifs que ceux obtenus avec des cellules normales. Cependant, les rétrovirus, qui s'insèrent dans les chromosomes avec le gène thérapeutique transporté, ne devraient pas être utilisés sur l'homme en raison du risque qu'ils ne provoquent un cancer. Pour ces expériences, les cellules souches dérivées des vaisseaux sanguins ont été extraites de souris non encore nées. Mais, s'il était possible de les extraire aussi d'enfants atteints de la dystrophie musculaire de Duchenne, ces résultat positifs inattendus signifieraient que nombre de problèmes liés aux expériences actuelles de transfert de gènes pourraient être évités, comme par exemple la faible efficacité, le rejet immunitaire et la nécessité de faire de nombreuses injections dans tous les muscles qui peuvent être atteints.
   Dans ces cellules extraites de patients, il faudrait pouvoir transférer des gènes de la dystrophine intacts par une technique ex vivo en utilisant les vecteurs connus, puis les multiplier en laboratoire et finalement, les réinjecter dans les artères les plus importantes de l'enfant. Il est possible qu'il faille répéter le traitement au bout de plusieurs mois, c'est pourquoi il est important que ces cellules ne soient pas rejetées par le système immunitaire. Un des avantages les plus importants avec cette technique serait alors que tous les muscles pourraient être atteints, y compris les muscles du cœur et de la respiration. Il s'agirait alors d'un traitement systémique requérant relativement peu d'injections comparé aux autres approches de thérapie génique (Cossu, Milan).

   Une expérience de la nature sur les cellules souches: A l'âge d'un an, un garçon atteint de la dystrophie de Duchenne a reçu des cellules souches de moelle osseuse de son père parce qu'il souffrait d'une autre maladie. Comme il était encore capable de marcher à l'âge de 14 ans malgré un déplacement du cadre de lecture causé par une délétion de l'exon 45, on s'est demandé si c'étaient les cellules souches provenant de la moelle épinière qui avaient fourni l'information nécessaire à la production de la nouvelle dystrophine. Des examens effectués sur du nouveau matériel de biopsie ont toutefois montré que les symptômes plus légers de la maladie n'étaient dus que pour une toute petite partie à la transplantation, mais surtout par une délétion supplémentaire spontanée de l'exon 44 qui fait que, dans l'ARNm, l'exon 46 suit directement l'exon 43. Ce saut d'exon normalise le cadre de lecture. De la dystrophine peut être produite à nouveau, mais elle est plus courte et provoque donc les symptômes d'une dystrophie de Becker (cf. paragraphe omission d'un exon). Ainsi, semble-t-il, au bout de 13 ans, une transplantation de moelle osseuse peut contribuer dans une certaine mesure au traitement de la dystrophie musculaire de Du-chenne, mais pas suffisamment pour modifier de façon significative le cours de la maladie (Kunkel, Boston).

   Thérapie cellulaire avec myoblastes: Les muscles ont leurs propres cellules souches, les cellules satellites ou myoblastes, qui, durant le développement ou la réparation des muscles, fusionnent les unes avec les autres pour donner des myotubes, puis de longues fibres musculaires. Parce que l'expression "transfert de myoblastes" a été utilisée à tort et à travers, on préfère aujourd'hui parler de cellules myogéniques plutôt que de myoblastes.
   Dans les années 1990 et 1991, toute une série d'essais cliniques ont été effectués chez des enfants atteints de la maladie de Duchenne avec une technique qui avait montré des résultats positifs chez la souris mdx: le transfert des myoblastes. Prélevées sur un donneur sain, le plus souvent le père de l'enfant, et contenant donc le gène normal de la dystrophine, ces cellules ont été injectées en de nombreux endroits, à 0,5 cm de distance, directement dans des muscles dystrophiques, avec l'espoir que des cellules musculaires avec dystrophine normale se forment. Ces expériences n'ont pas réussi chez les garçons atteints de la maladie de Duchenne parce que les myoblastes n'ont pas migré suffisamment loin des points d'injection, qu'il y a eu des problèmes immunologiques et que, surtout, presque tous les myoblastes injectés sont morts peu après (Karpati, Montréal et d'autres).

   Nouveaux essais de transplantation de myoblastes: Les expériences se poursuivent pour tenter de déterminer pourquoi bien moins de 1% des myoblastes transplantés dans des fibres musculaires dystrophiques survivent. On tente actuellement de caractériser ces quelques cellules actives et de trouver la manière de les distinguer des cellules inactives. C'est pourquoi, on est à la recherche de signaux moléculaires, c'est-à-dire de substances particulières dans les cellules musculaires capables d'activer les myoblastes (Partridge, Londres).
   Dans les premières expériences, seuls deux médicaments connus, la cyclosporine A et le cyclophosphamide, avaient été utilisés pour supprimer les réactions immunitaires chez les patients dystrophiques. A l'heure actuelle, d'autres substances ont été étudiées dans des essais sur des singes. On a ainsi montré que l'inhibiteur d'immunité FK506, seul ou associé à l'inhibiteur MMF, prévenait beaucoup mieux les rejets pendant plusieurs mois. Une plus grande densité de sites d'injection distants de 1 mm seulement et un plus grand nombre de cellules transplantées ont contribué à ce que, chez les singes, jusqu'à 67 % des cellules musculaires aient absorbé les myoblastes, elles sont alors devenues des cellules musculaires hybrides (Tremblay, Québec City).
   Une étude clinique utilisant la technique modifiée a débuté au Canada (cf. section "Essais cliniques"). Dans d'autres laboratoires, aussi, le travail est en cours pour améliorer cette technique de thérapie génique. On a ainsi découvert que m144, une protéine du système immunitaire, prévenait la mort immédiate des myoblastes après leur transplantation dans les muscles de souris (Hodgetts, Crawley, Australie).

   Essais de thérapie génique ex vivo: En isolant des myoblastes d'un patient atteint de la dystrophie de Duchenne, en y introduisant le gène correct de la dystrophine et en réinjectant ensuite ces myoblastes, on éviterait la plupart des problèmes immunologiques. Dans des expériences préliminaires, l'électroporation a été utilisée pour transporter des plasmides contenant le gène d'une protéine marqueur fluorescente à travers la membrane cellulaire de myoblastes humains en culture. Cette technique perméabilise temporairement les membranes par le biais d'une décharge électrique unique, par exemple 400 V sur une distance de 4 mm. Dans les conditions optimales, jusqu'à 70% des myoblastes ont été transférés avec le gène et ont exprimé la protéine marqueur. La capacité des myoblastes à fusionner en myotubes, un autre stade du développement musculaire, n'a pas été altérée. (Bernheim, Genève)

   Réparation du gène chez le chien GRMD: Des essais de réparation de mutations ponctuelles au niveau du gène sont effectués en utilisant de courts oligonucléotides chimériques qui contiennent à la fois de l'ARN sur un brin et de l'ADN sur l'autre. Le brin d'ADN des oligonucléotides chimériques est parfaitement complémentaire de la séquence correcte du gène au site de la mutation ponctuelle du gène, tandis que la portion d'ARN est parfaitement complémentaire de la séquence mutée. Cela entraîne la formation de structures appariées en quadruplex, des quadruples brins, qui sont capables de corriger une si petite mutation en activant les mécanismes cellulaires naturels de réparation de l'ADN.
   Avec cette technique, un oligonucléotide d'ADN et d'ARN complémentaire de la mutation au site d'épissage du gène de la dystrophine chez le chien dystrophique GRMD a été injecté à un chien de 6 semaines affecté de la maladie. Le muscle traité a présenté (1) des signes de restauration de l'exon qui était absent du fait de la mutation, (2) la restauration de la région de la protéine codée par l'exon manquant dans la protéine complète, dont il a été observé qu'elle était localisée correctement dans la membrane du muscle, et (3), fait très important, la démonstration que ce gène sur le chromosome X avait été corrigé. La réparation de la mutation s'est maintenue pendant presque une année chez ce chien (Bartlett, Bethesda).

   Réparation du gène chez la souris mdx: Dans une expérience similaire, la mutation ponctuelle dans l'exon 23 de myoblastes de souris mdx a été réparée in vitro et ces myoblastes ont ensuite fusionné en myotubes qui ont produit de la dystrophine normale complète. Deux semaines après une injection unique d'oligonucléotides dans les muscles de souris mdx, de 1 à 2% des fibres se trouvant autour du site d'injection contenaient de la nouvelle dystrophine, qui n'était pas de la dystrophine produite par réversion, c'est-à-dire de la dystrophine normale résultant d'une suppression spontanée de la mutation. Cette quantité de dystrophine nouvelle est restée stable pendant 10 semaines au moins (Rando, Palo Alto).

   Omission d'exon: On tente au moyen de cette technique de transformer une mutation de Duchenne en une mutation de Becker. Cela peut se faire par induction du mécanisme d'épissage, qui élimine les introns de l'ARN pré-messager, afin d'éliminer également un exon spécifique après qu'une mutation ponctuelle ou une délétion a décalé le cadre de lecture et provoqué ainsi une interruption prématurée de lecture. L'objectif de cette approche est de restaurer le cadre de lecture perturbé.
   Le gène avec sa mutation n'est pas modifié par l'omission d'exon, seul l'ARN messager, l'ARNm, ne contient plus l'information de l'exon omis. L'ARNm étant plus court que la normale, la protéine de dystrophine est également plus courte, elle contient moins d'acides aminés. Si les acides aminés manquants font partie de la région centrale de la dystrophine, ils ne sont pas essentiels et la protéine plus courte qui en résulte peut encore jouer son rôle stabilisateur au niveau de la membrane de la cellule musculaire. Le résultat en sera un passage des graves symptômes de la dystrophie de Duchenne aux symptômes beaucoup plus légers de la dystrophie musculaire de Becker.

   Elimination de la mutation de la souris mdx: Cette approche a été utilisée pour contourner le défaut d'un seul nucléotide, la mutation ponctuelle dans l'exon 23 de la souris mdx. Un oligonucléotide antisens, consistant en 20 unités de nucléotides complémentaires de la séquence d'ARN du pré-ARNm, dans la région qui va de l'exon 23 à l'intron 23, a induit l'omission de l'exon contenant la mutation pendant le processus d'épissage. L'information génétique de l'exon 23 du gène, qui code pour 71 acides aminés dans le domaine en bâtonnet, a été ainsi omise durant le processus de lecture.
   Cet oligoribonucléotide antisens, ainsi que d'autres aussi étudiés, ont été modifiés chimiquement, par exemple en protégeant les groupes OH normalement libres et sensibles des unités de ribose de l'ARN par des groupes méthyle (-CH₃). Environ 5 microgrammes (millionièmes de grammes) de ces "médicaments géniques" potentiels stabilisés ont été injectés avec le détergent F127 dans les muscles de la patte de souris mdx vivantes. Au bout de deux à quatre semaines, près de 20 % des fibres musculaires contenaient une quantité quasi normale de dystrophine légèrement raccourcie. Et, avec les autres constituants du complexe de la dystrophine, celle-ci se trouvait bien sur la membrane cellulaire. La force du muscle a été nettement augmentée, sans toutefois être entièrement normale. La répétition du traitement a eu pour effet une augmentation du nombre de fibres musculaires contenant de la dystrophine sans rejet immunitaire (Wilton, Perth, Partridge, Londres).

   Omission d'exon dans l'ARNm de la dystrophine humaine: L'exon 45 du gène de la dystrophine est l'exon le plus fréquemment supprimé chez les garçons atteints de la maladie de Duchenne. Cette délétion entraîne un déplacement du cadre de lecture dans l'ARNm et l'apparition d'un codon stop prématuré, dont la conséquence est une protéine de dystrophine tronquée et non fonctionnelle qui est ensuite dégradée dans les cellules musculaires. Toutefois, si les exons 45 et 46 sont tous deux supprimés, le cadre de lecture n'est pas perturbé, il n'est pas déplacé, et le résultat en est une dystrophine plus courte que la normale dans laquelle il manque une suite de 108 acides aminés non essentiels dans la partie centrale de la protéine. Les patients qui portent ce type de mutation présentent les symptômes plus légers de la dystrophie musculaire de Becker.
   Des expériences in vitro visant à la suppression spécifique de l'exon 46 dans le pré-ARNm de la dystrophine dans des myotubes de souris mdx ont été menées avec succès au moyen de 4 oligonucléotides antisens d'ARN différents et complémentaires d'une séquence spécifique régulatrice de l'épissage située au sein de l'exon 46. Avec ces oligonucléotides, on bloque une séquence de reconnaissance d'exon (ERS) ou un activateur d'épissage exonique (ESE), structures nécessaires au processus d'épissage, la jonction des exons dans l'ARNm.
   Des expériences in vitro similaires ont alors été effectuées avec plusieurs oligonucléotides antisens d'ARN du site d'épissage analogue de l'exon 46 humain. Avec l'un d'entre eux, composé de 19 nucléotides, il a été possible de supprimer l'exon 46 dans environ 15% du pré-ARNm de la dystrophine, dans des myotubes obtenus à partir de deux patients atteints de la maladie de Duchenne qui présentaient une délétion de l'exon 45 (on trouvera à la dernière page de ce rapport les détails au niveau moléculaire de cette expérience).
   Ce pourcentage d'ARNm raccourcis ne contenant pas les exons 45 et 46 a entraîné la formation de quantités normales de dystrophine raccourcie dans 75% des myotubes au moins. Après 16 heures, on a pu détecter cette nouvelle dystrophine dans les cellules, mais après 48 heures, elle s'était déplacée vers la membrane cellulaire où elle est restée une semaine au moins. La réapparition de la dystrophine a entraîné la restauration du complexe de la dystrophine dans - et sous la membrane de la cellule musculaire. Entre temps, le cadre de lecture a pu être corrigé dans des préparations in vitro de muscles de six autres patients victimes de délétions différentes et d'une mutation ponctuelle.
   Cette technique s'est avérée hautement spécifique, ne produisant la suppression que du seul exon visé. Avec la même technique, il a été possible d'omettre 18 autres exons dans des cellules musculaires en culture. Ainsi, cette stratégie très prometteuse, dont la validité a été démontrée par des expériences en éprouvette, pourrait ultérieurement permettre la conversion des mutations Duchenne en mutations Becker chez plus de 65% des patients présentant des délétions.
   On étudie actuellement diverses méthodes pour transférer les oligoribonucléotides antisens dans un organisme vivant. A cet effet, on conduit des expériences sur des souris vivantes qui ont dans leurs muscles, à la place de leur propre gène de la dystrophine, le gène humain, lui-même altéré par des délétions "humaines". La conduite d'essais cliniques chez des garçons atteints de la dystrophie musculaire de Duchenne ne pourra être envisagée qu'après que ces études sur souris "humanisées" auront donné des résultats positifs.
   Comme on connaît dans tous ses détails la structure du gène de la dystrophine, il est déjà possible de déterminer l'exon à omettre pour restaurer le cadre de lecture après une délétion ou une mutation ponctuelle particulière. Pour l'instant, une telle détermination n'est que purement théorique. Il n'est pas certain que les résultats obtenus sur des cellules en culture ou sur des souris seront les mêmes sur des garçons atteints de la dystrophie musculaire de Duchenne, et il n'est pas davantage certain que la dystrophine restaurée mais raccourcie puisse, dans un cas donné, conduire aux symptômes d'une dystrophie musculaire de Becker (van Ommen, van Deutekom, Leiden).
   Les sites d'épissage sont des séquences d'ARN spécifiques aux extrémités des exons, qui sont essentielles pour une élimination correcte des séquences introniques non codantes à partir du pré-ARNm. Cet ARN pré-messager est le premier produit d'un gène actif; après élimination des séquences introniques par épissage, il devient l'ARN messager, ARNm, qui se déplace vers les ribosomes où il agit comme porteur d'information pour la synthèse des protéines.

   Omission d'exon avec des oligonucléotides produits localement: Dans une autre technique d'omission des exons, les oligoribonucléotides antisens n'ont pas besoin d'être injectés, mais sont synthétisés dans le noyau lui-même des cellules, là où on a besoin d'eux, après transfert de leur gène. Les séquences d'introns sont séparées du pré-ARNm dans le noyau cellulaire par des organelles d'épissage. Ce sont des structures complexes faites de plusieurs protéines et petits ARN nucléaires (ARNsn), qui reconnaissent les limites exon-intron et qui joignent les exons après épissage avec précision et sans déplacement du cadre de lecture.
   Les ARNsn U7 sont quelques uns de ces ARN très courts. Ils se lient aux sites d'épissage sur des séquences de reconnaissance particulières dans le pré-ARNm, bloquent l'épissage d'exons spécifiques et s'assurent ainsi que plusieurs protéines de différentes longueurs sont produites par un seul gène. Les ARNsn U7 régulent normalement les processus d'épissage de l'ARNm des histones. Les histones sont des protéines nécessaires pour emballer l'ADN dans les chromosomes.
   Pour cette nouvelle méthode, des ARNsn U7 ont été génétiquement modifiés de sorte qu'ils ne se sont plus liés au pré-ARNm de l'histone, mais seulement aux sites d'épissage dans la région de l'exon 23 du pré-ARNm de la dystrophine de souris. Pour y parvenir, on a emballé ensemble un gène codant pour les ARNsn U7 modifiés et un promoteur de la CK dans des plasmides servant de vecteurs puis, dans une expérience de laboratoire, transférées dans des myoblastes isolés de la souris. Ces cellules se sont ensuite différenciées en cellules musculaires en milieu de culture.
   Dans les noyaux des myoblastes transgéniques, le gène transféré a donné naissance à des ARNsn U7 modifiés. Ceux-ci avaient de nouvelles séquences de reconnaissance et étaient liés, avant et après l'exon 23 du pré-ARNm de la dystrophine, à des sites importants pour l'épissage. Ainsi donc, ces sites d'épissage étaient bloqués et l'exon 23 était emmené avec les introns au cours de l'épissage du pré-ARNm (omission d'exon). Comme la mutation ponctuelle des souris mdx est située dans l'exon 23, le retrait de cet exon a eu pour conséquence que les cellules musculaires mdx, incapables de produire de la dystrophine normale, se sont alors mises à fabriquer une protéine dystrophine légèrement raccourcie localisée sur son site correct sous la membrane cellulaire.
   Le but de cette expérience génique in vitro fondamentale - à l'extérieur de la souris vivante - était de démontrer que les cellules musculaires elles-mêmes étaient capable de produire les oligoribonucléotides antisens thérapeutiques.
   Pour une application sur l'homme, il faudrait utiliser des ARNsn U7 adaptés à la mutation spécifique du patient, et leur gène transporté avec un vecteur thérapeutique de gène dans les noyaux cellulaires des fibres musculaires. Une alternative serait un transfert ex vivo dans lequel les gènes ARNsn U7 seraient transportés dans des cellules satellites ou d'autres cellules souches musculaires puis injectés dans la circulation sanguine ou directement dans les muscles. Comme les gènes ARNsn U7 sont très courts, ce transfert devrait être probablement plus facile que le transfert de l'ADNc de la dystrophine entière ou raccourcie, tel qu'il est actuellement expérimenté avec d'autres méthodes (Weis, Berne; Lochmüller, Munich).

   Recombinaison homologue: La mutation ponctuelle dans le gène de la dystrophine des souris mdx a pu être réparée dans 15 à 20% des myoblastes isolés, par le biais de l'addition d'un ADN de 603 nucléotides dont la séquence était la même de part et d'autre de la mutation de l'exon 23 des souris, mais ne contenait pas l'échange C-à-T de la mutation. Une partie du nouveau segment de gène a été échangée contre le segment homologue contenant la mutation C-à-T dans l'exon 23 des souris. Cette technique dite de recombinaison homologue d'un fragment court, SFHR, a été ensuite appliquée à des myoblastes isolés provenant d'un patient atteint de la maladie de Duchenne présentant une mutation de délétion dans l'exon 13 (Kapsa, Melbourne).

   Des antibiotiques pour ignorer un codon stop prématuré: Près de 5% des garçons atteints de la maladie de Duchenne ont une mutation ponctuelle dans leur gène de la dystrophine qui a changé le mot de code pour un acide aminé en l'un des trois codons stop, TGA, TAG et TAA, endroits où, après la transcription en ARNm, la synthèse de dystrophine s'arrête de façon prématurée.
   La gentamicine est un antibiotique qui fait en sorte que le mécanisme de traduction de l'ARN ignore de tels codons stop prématurés et continue donc la lecture au-delà du codon stop. Les codons stop normaux, qui sont protégés par une structure tridimensionnelle particulière, seront néanmoins utilisés comme auparavant. Chez la souris mdx, l'on a obtenu de cette manière jus-qu'à 20% de la quantité normale de dystrophine nouvelle et fonctionnelle. La gentamicine présente l'avantage d'être un médicament bien connu dont l'utilisation comme traitement de la dystrophie musculaire ne nécessiterait pas de longues procédures d'autorisation (Sweeney, Philadelphie).
   Pour confirmer ces résultats positifs, deux autres études sur des souris mdx ont été effectuées, qui ont cependant montré que dans des conditions semblables, on n'a pu détecter aucune dystrophine nouvelle après traitement à la gentamicine (Karpati, Montréal; Lochmüller, Munich).
   Deux études cliniques avec la gentamicine ont été faites chez des garçons atteints de la dystrophie de Duchenne qui n'ont pas non plus donné de dystrophine nouvelle. Il est possible que la période d'essai de 14 jours ait été trop brève pour que des effets positifs sur la synthèse de dystrophine aient pu se manifester. C'est la raison pour laquelle un autre essai plus long portant sur 36 patients est actuellement en cours (Mendell, Columbus).

Activation de l'utrophine: L'utrophine est une protéine très semblable à la dystrophine dans sa structure et sa fonction. Chez l'homme, son gène est situé sur le chromosome 6, il contient 75 exons et a une longueur de 1 million de nucléotides environ. La protéine utrophine est plus courte que la dystrophine d'environ 7%. On la trouve dans de nombreux tissus du corps et aussi dans le muscle, mais elle y est concentrée dans les régions où les motoneurones entrent en contact avec la membrane du muscle. Avant la naissance, la concentration d'utrophine dans le muscle est beaucoup plus élevée que par la suite. Cette protéine, bien qu'elle ne soit présente qu'en petites quantités, atténue les symptômes de la dystrophie de Duchenne, moins sévères qu'ils ne seraient si l'utrophine était aussi absente. En fait, les souris mdx dont le gène de l'utrophine a été invalidé expérimentalement, et qui n'ont donc ni dystrophine ni utrophine, ont des symptômes type Duchenne et meurent précocement, contrairement aux souris mdx "normales" dont les muscles ne dégénèrent pas.
   Des expériences effectuées chez la souris ont montré que, si elle est présente en quantités suffisantes, l'utrophine peut remplacer la dystrophine. Les souris utilisées étaient des souris transgéniques dont la lignée germinale contenait des mini-gènes d'utrophine introduits par une technique qui ne peut pas être utilisée chez l'homme. On a élevé d'autres souris transgéniques qui ne produisent de l'utrophine que si l'eau qu'elles boivent contient l'antibiotique tétracycline. Cette augmentation de la quantité d'utrophine a empêché l'apparition de symptômes de Duchenne; cet effet a été plus marqué chez les souris nouveau-nées que chez celles âgées de 10 ou 30 jours.
   Pour une éventuelle thérapie de la maladie de Duchenne, une autre stratégie est appliquée, qui consiste à augmenter les quantités normalement basses d'utrophine par une augmentation de l'activité de son gène. A cet effet, une substance activatrice est requise, qui pourrait être un médicament connu ou une autre substance chimique naturelle.
   Grâce à des systèmes automatiques de tests in vitro, des milliers de composés chimiques, dont certains sont produits automatiquement par chimie combinatoire, sont testés en laboratoire sur des cultures de cellules de souris mdx pour leur capacité à activer l'expression du gène de l'enzyme luciférase, qui est précédé de deux promoteurs du gène de l'utrophine. Cet enzyme, extrait des lucioles, produit de la lumière et est plus facile à déceler que l'utrophine. Tout positif, c'est-à-dire tout composé actif dans ces tests préliminaires, sera encore modifié, puis, toutes ces substances similaires examinées, tout d'abord sur des cultures de cellules musculaires puis, si elles réagissent positivement, sur des souris mdx vivantes pour leur potentiel d'activation du gène de l'utrophine. Ce n'est qu'après qu'on aura trouvé une ou plusieurs substances actives que des essais cliniques sur des personnes atteintes de la dystrophie musculaire de Duchenne pourront commencer, c'est-à-dire dans quelques années (Davies, Oxford).
   Un tel activateur de l'expression du gène de l'utrophine pourrait, s'il est une molécule de petite taille, être administré au travers de la circulation sanguine et atteindre tous les muscles. De plus, le système immunitaire reconnaîtrait l'utrophine additionnelle comme une substance endogène puisque déjà présente en petites quantités chez les garçons atteints de la dystrophie musculaire de Duchenne et il n'y aurait donc pas de problèmes de rejet.
   Cependant, une substance qui active le gène de l'utrophine pourrait faire de même avec d'autres gènes, aussi. Par conséquent, avant de tester un tel activateur chez l'enfant, il faudra s'assurer que l'application thérapeutique ultérieure ne produira pas d'effets secondaires indésirables.

   Autres tentatives d'augmenter la quantité d'utrophine: Le transfert d'un gène raccourci de l'utrophine au moyen d'adénovirus à des chiens dystrophiques a fourni de l'utrophine qui a pu reprendre la fonction de la dystrophine manquante. --- Les glucocorticoïdes, et parmi eux la prednisone, peuvent activer dans une certaine mesure le gène de l'utrophine. --- De tels corticoïdes ont aussi été extraits de plantes médicinales chinoises utilisées traditionnellement contre la dystrophie musculaire. --- Une faible inflammation chronique dans des muscles de souris mdx entraîne une augmentation marquée de l'expression d'utrophine dans des régions membranaires éloignées des endroits où les motoneurones les touchent. --- La L-arginine, un acide aminé, peut augmenter la quantité d'utrophine chez la souris mdx et soulager notablement les symptômes dystrophiques. L'enzyme synthase de l'oxyde nitrique utilise l'arginine pour produire l'oxyde nitrique, un gaz à activité biologique. Mais comme l'oxyde nitrique est aussi actif dans d'autres processus biologiques, il n'est pas possible d'employer l'arginine pour la thérapie de la maladie de Duchenne sans autres investigations complémentaires. --- La petite protéine hereguline, avec laquelle les motoneurones stimulent le développement musculaire, peut aussi considérablement soulager les symptômes des souris mdx. --- Une extrémité de l'ARNm de l'utrophine n'est pas traduite en protéine, mais se lie à des structures dans les zones de contact avec les nerfs, limitant ainsi l'utrophine à ces sites. Si un médicament pouvait empêcher cette liaison, il serait possible d'avoir une distribution plus homogène de l'utrophine sur l'ensemble de la membrane musculaire de manière à ce qu'elle remplace mieux la dystrophine. --- Une autre forme très similaire d'utrophine, l'utrophine B, a été découverte récemment dans les vaisseaux sanguins. Mais seule la forme "normale", l'utrophine A, se trouve dans les muscles et peut compenser partiellement la dystrophine manquante après activation de son gène.

Activité de milliers de gènes de muscles: Pour pouvoir mesurer simultanément l'activité d'un très grand nombre de gènes dans un échantillon de tissu en une seule expérience, on utilise des puces à ADN. Comme la quasi totalité des séquences de gènes humains est connue, il est possible de produire automatiquement des segments courts de milliers de gènes et de les déposer avec un robot suivant un certain patron sur une plaquette de quartz de quelques centimètres carrés. Si des copies biochimiques d'ADN des ARNm de tous les gènes actifs sont déposées sur la plaquette pour servir d'échantillon à analyser, des points lumineux apparaîtront aux endroits de cette plaquette où se trouvent des séquences d'ADN complémentaires de ces gènes actifs. L'intensité lumineuse de ces points est mesurée automatiquement, ce qui permet alors de déterminer quels gènes sont actifs et à quel degré, et quels sont ceux qui ne le sont pas.
   Avec ce profilage d'expression, plusieurs milliers de gènes ont été testés dans des échantillons de muscles prélevés sur des souris normales et mdx, sur des garçons bien portants et des dystrophiques de Duchenne, sur des souris transgéniques qui n'avaient ni leur propre dystrophine ni utrophine, ainsi que sur d'autres souris qui avaient par contre de la dystrophine humaine dans leurs muscles.
   Les résultats ont montré que l'absence de dystrophine provoquait l'augmentation et la diminution de l'activité de nombreux gènes de muscles. Toute une série de gènes responsables de la production d'énergie dans les cellules musculaires ont été moins actifs chez les souris sans dystrophine ni utrophine, c'est-à-dire que leurs muscles étaient victimes d'une pénurie d'énergie qui a contribué à la dégénérescence de leurs muscles dystrophiques. D'un autre côté, de nombreux gènes nécessaires au développement et à la réparation de muscles ont vu leur activité augmenter, parfois d'un facteur cent, ils étaient activés par le cours de la maladie. Des résultats similaires ont été obtenus avec des échantillons de muscles humains.
   D'autres expériences ont montré que, chez la souris, de nombreux autres gènes étaient activés, des gènes qui sont impliqués dans le développement de structures de surface, dans la production de signaux pour la synthèse des protéines, dans l'intensification des réactions immunitaires et dans d'autres processus responsables pour les symptômes de la dystrophie musculaire des souris mdx. Chez les personnes atteintes de la maladie de Duchenne, ces changements ont été moins prononcés et, chez la souris transgénique avec dystrophine humaine, l'activité de ces gènes a été normale parce qu'elles n'avaient plus de dystrophie musculaire.
   Après que ces premiers résultats ont été obtenus, il y a quelques années, beaucoup d'autres expériences ont été effectuées avec cette nouvelle technique pour répondre à d'autres questions que pose la recherche sur la dystrophie musculaire de Duchenne. Leurs résultats, et tous ceux à venir, permettront de comprendre la relation complexe entre les nombreux éléments de l'architecture musculaire et ses changements lorsqu'un de ses composants les plus importants, la dystrophine, est absente. Ceci ouvrira de nouvelles perspectives pour le développement d'un traitement de la maladie de Duchenne (van Ommen, Leiden; Kunkel, Boston; Hoffman, Washington, et d'autres).

   Un ver dystrophique: Caenorhabditis elegans est un ver transparent long de 0,9 millimètres, beaucoup utilisé par les chercheurs en génétique parce que ses 19.733 gènes sont connus, de même que les 959 cellules de son corps, dont 95 sont des cellules musculaires. Ses muscles possèdent une dystrophine similaire à celle de l'homme, qui peut aussi subir des mutations entraînant des symptômes dystrophiques.
   Certains gènes ont été inactivés, mais aussi activés, de manière à ce qu'on puisse étudier les symptômes dystrophiques provoqués par l'absence ou l'augmentation de l'activité du gène. Par exemple, on a pu montrer que l'activation de la dystrobrévine, une forme extrêmement courte de dystrophine, a ralenti fortement la dégénérescence musculaire. D'autres investigations contribueront à une meilleure compréhension de relations moléculaires encore inconnues qui accompagnent le développement de la dystrophie musculaire (Ségalat, Lyon).

   Intégrines et syntrophines: Les intégrines constituent une famille de protéines situées dans la membrane des cellules musculaires. Elles sont nécessaire à la fusion des myoblastes en myotubes et au développement des myotubes en cellules musculaires parvenues à maturation. Elles participent aussi à la propagation des signaux de cellule à cellule.
   Chez la souris gravement dystrophique, qui n'a ni dystrophine ni utrophine, la quantité de l'une de ces intégrines a été multipliée par deux environ par transfert génique. Cette manipulation a multiplié par trois l'espérance de vie des souris tandis que leurs symptômes dystrophiques se sont nettement améliorés (Kaufman, Urbana).
   Les cinq syntrophines connues sont des protéines qui jouent le rôle d'intermédiaires dans l'interaction de protéines de signalisation avec les complexes de dystrophine et d'utrophine au niveau de la membrane cellulaire du muscle. Une meilleure compréhension de cet effet aura des conséquences sur la thérapie par l'utrophine (Froehner, Seattle).